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现代育种技术的不断进步,快大型肉鸡实现了更快的生长速度和更高的饲料转化率。但定向选育使肉鸡养殖过程中腿病问题突出,严重影响了肉鸡养殖业的经济效益。肢体内外翻畸形（Valgus-varus deformity,VVD）是当前肉鸡养殖业中最常见的腿病之一。VVD是一种肉鸡和火鸡常见的长骨畸形病,以胫跗骨和跗跖骨之间内翻或外翻为特征,严重影响了肉鸡的运动能力和肉品质。然而,目前对VVD肉鸡发生的遗传病因尚不清楚,制约了针对该病的遗传选育,目前尚未有效的防治方法。本研究以科宝肉鸡VVD为研究对象,运用全基因组甲基化测序技术,构建甲基化图谱,筛选关键致病基因,进一步在细胞水平上进行功能验证,主要结果如下:研究一:VVD肉鸡软骨组织全基因组DNA甲基化研究1、以35日龄科宝肉鸡软骨组织为材料（VVD组和正常组肉鸡各3只）,进行全基因组甲基化测序,共获得219.8 Gb数据。2、VVD组和正常组肉鸡软骨组织的全基因组甲基化图谱显示:在CG序列环境中,VVD组筛选出相对更多的高甲基化水平的差异甲基化区域（DMR）,而正常组筛选出相对更多的低甲基化水平的DMRs。VVD肉鸡的总体甲基化水平高于健康组。3、通过分析VVD组和正常组肉鸡软骨组织的全基因组甲基化测序数据,筛选得到4315个DMRs。从这些DMRs中共鉴定出2326个差异甲基化基因（DMG）,其中1159个基因存在甲基化水平上调的DMRs,936个基因存在甲基化水平下调的DMRs,231个基因存在两种类型DMRs。这些DMGs主要富集在细胞发育、细胞分化、胚胎发育和骨骼发育等相关通路。研究二:VVD肉鸡腿肌组织全基因组DNA甲基化研究1、以35日龄科宝肉鸡腿肌组织为材料（VVD组和正常组肉鸡各3只）,进行全基因组甲基化测序,共获得217.9 Gb数据。2、VVD组和正常组肉鸡腿肌组织的全基因组甲基化图谱显示:正常组筛选出相对更多的高甲基化水平DMRs,而VVD组筛选出相对更多的低甲基化水平的DMRs。3、通过分析VVD组和正常组肉鸡腿肌组织的全基因组甲基化测序数据,筛选得到2609个DMRs,从这些DMRs中共鉴定出1555个DMGs,其中768个基因的存在甲基化水平上调的DMRs,613个基因存在甲基化水平下调的DMRs,174个基因存在两种类型DMRs。这些DMGs主要富集在蛋白质降解、肌肉萎缩、骨骼肌合成与分解失调等相关通路。研究三:VVD肉鸡软骨组织致病基因筛选及功能验证1、VVD肉鸡软骨组织甲基化数据与转录组数据的联合分析结果显示:在CG序列环境中,基因前后2 Kb区域甲基化水平和mRNA表达水平呈负相关;在CHG和CHH序列环境中基因前后2 Kb区域甲基化水平和mRNA表达水平呈正相关。差异甲基化基因和差异表达基因联合分析结果显示,63个基因存在交集。63个基因的蛋白互作分析结果显示,ESPL1、PRC1、MELK、KIF2C、MK167、CDK1和NCAPG蛋白存在互作关系。2、相关性分析结果表明,候选基因ESPL1启动子区的DNA甲基化水平与mRNA表达水平呈负相关关系（r=-0.6073,P=0.2011）。ESPL1基因启动子区差异甲基化区域显示了19个潜在的转录结合位点。3、甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（5-AzaC）对软骨细胞活性影响的结果显示,当添加不同浓度5-AzaC作用12 h的时候,只有1000μmol/L 5-AzaC组的软骨细胞活性受到抑制（P＜0.05）;24 h的时候,三个实验组的软骨细胞活性均受到抑制,当5-AzaC添加浓度为10μmol/L和1000μmol/L时,实验组软骨细胞活性极显著低于对照组（P＜0.01）;当添加浓度为10μmol/L 5-AzaC时,实验组软骨细胞活性显著低于对照组（P＜0.05）。36 h的时候,实验组软骨细胞活性均低于对照组,其中10μmol/L 5-AzaC组达到显著水平（P＜0.05）,1000μmol/L 5-AzaC组达到极显著水平（P＜0.05）,而100μmol/L 5-AzaC组未达到显著水平。48 h的时候,仅有1000μmol/L 5-AzaC组的软骨细胞活性显著低于对照组（P＜0.05）。4、在不影响软骨细胞活性的前提下添加浓度100μmol/L甲基转移酶抑制剂作用12 h,试验组中的ESPL1的mRNA表达量极显著高于对照组的表达量（P＜0.01）,DNMT1的mRNA表达量极显著低于对照组（P＜0.01）,DNMT3A的mRNA表达量显著低于对照组（P＜0.05）。研究四:VVD肉鸡腿肌组织致病基因筛选及功能验证1、VVD肉鸡腿肌组织甲基化数据与转录组数据的联合分析结果显示:在CG序列环境中,基因前后2 Kb区域甲基化水平和mRNA表达水平呈负相关;在CHG和CHH序列环境中,基因前后2 Kb区域甲基化水平和mRNA表达水平呈正相关。147个基因的蛋白互作分析结果显示,FOS、MYL9、HSPB1、FRAS1、GLI2、CACNA1C和CNR1基因处于核心位置。2、相关性分析结果表明,候选基因MYL9启动子区的两个DMRs的DNA甲基化水平与mRNA表达水平均呈负相关关系（r1=-0.7372,P1=0.0945;r2=-0.7448,P2=0.0894）。MYL9基因启动子区差异甲基化区域显示Sp1、Egr-1和E2转录因子可能与差异甲基化区域结合。3、甲基转移酶抑制剂5-AzaC对成肌细胞活性影响的结果显示,当添加不同浓度5-AzaC作用12 h、24 h和48 h的时候,100μmol/L 5-AzaC组和1000μmol/L 5-AzaC组成肌细胞活性均极显著低于对照组（P＜0.01）;10μmol/L 5-AzaC组成肌细胞均未受到影响。36 h的时候,三个实验组的成肌细胞活性均极显著低于对照组（P＜0.01）。4、在不影响成肌细胞活性的前提下添加浓度10μmol/L甲基转移酶抑制剂作用24 h,试验组中的MYL9的mRNA表达量极显著高于对照组（P＜0.01）,DNMT1、DNMT3A的mRNA表达量极显著低于对照组（P＜0.01）。