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背景与目的:胰岛素抵抗是肝脏、肌肉、脂肪等外周组织对胰岛素耐受和对葡萄糖利用障碍的慢性病理过程,且与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。尽管已就胰岛素抵抗与肿瘤的关系进行了大量的探索性研究,但迄今有关胰岛素抵抗与肝癌细胞药物耐受性关系及机制的研究少见。本研究运用高浓度胰岛素诱导肝癌HepG2细胞建立稳定胰岛素抵抗细胞模型(HepG2/IR),研究胰岛素抵抗的HepG2细胞对常规化疗药物的敏感性,以及细胞自噬活性和内质网应激反应变化,探讨肝癌胰岛素抗性与药物敏感性的关系,揭示自噬活性与内质网应激反应在胰岛素抵抗肝癌细胞药物耐受性中的作用及机制。方法:采用高浓度胰岛素长时间诱导HepG2建立具有良好胰岛素抵抗性的HepG2/IR细胞模型,GOD-POD法测定细胞葡萄糖消耗量,PAS染色观察糖原合成能力,实时定量RT-PCR法和流式细胞术检测胰岛素受体(Insulin receptor substrate,InsR)和葡萄糖转运蛋白-2(Glucose transporter-2,GLUT-2)表达水平,并观察细胞黏附、迁移及侵袭的能力。MTT法检测细胞的增殖活性,Annexin V/PI双染流式细胞术测定细胞凋亡,透射电子显微镜观察细胞及内质网超微结构,单丹磺酰戊二胺(MDC)染色后荧光显微镜观察细胞内自噬泡。Western-blotting法检测自噬(巨自噬和分子伴侣介导的自噬)相关蛋白Beclin-1、LC3、P62、HSC70及LAMP2a,内质网应激相关蛋白GRP78、XBP-1、PERK,凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2以及P-糖蛋白(P-gp)的表达,流式细胞术检测活性氧、线粒体膜电位以及P-gp功能。结果:1.0.5-1μmol/L胰岛素持续诱导HepG2细胞72 h建立的HepG2/IR细胞较其亲本HepG2细胞葡萄糖消耗量和糖原合成明显降低、胰岛素受体和葡萄糖转运蛋白-2表达明显下调,撤除胰岛素后正常培养72h后依然维持。HepG2/IR细胞经10mmol/L的胰岛素增敏剂盐酸吡格列酮(Pioglitazone hydrochloride,PH)作用上述改变被逆转。证实HepG2/IR细胞获得了具有较稳定的岛素抵抗性。与亲本HepG2细胞比较,HepG2/IR细胞对顺铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、丝裂霉素的敏感性显著降低,半数抑制浓度(IC50)分别增高0.59-2.80倍,细胞凋亡率分别降低13.21-24.64%,PH逆转胰岛素抗性其药物敏感性恢复至接近于亲本HepG2细胞。顺铂诱导细胞凋亡中HepG2/IR细胞较HepG2细胞的凋亡抑制蛋白Bcl-2增高23.89%,凋亡促进蛋白Caspase-3降低33.16%。同时,HepG2/IR细胞的黏附、迁移及侵袭能力均明显增强,采用PH逆转胰岛素抗性可使其降低并接近于亲本HepG2细胞。提示肝癌细胞发生胰岛素抵抗后获得高水平的耐药性以及增强的细胞黏附、迁移和侵袭能力。2.电镜和MDC染色结果显示HepG2/IR细胞较其亲本HepG2细胞的自噬泡明显增多,胰岛素抵抗诱导过程中自噬活性明显增强,巨自噬水平在诱导早期发生增高而在晚期降低,分子伴侣介导的自噬水平升高较晚且具有较长时间的稳定性,胰岛素增敏剂PH逆转胰岛素抗性细胞自噬活性明显降低。顺铂(DDP)均可诱导HepG2/IR细胞和HepG2细胞凋亡,并伴随着自噬活性的增高。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬可以提高HepG2/IR细胞及HepG2细胞对顺铂的敏感性,凋亡率较DDP单独处理组分别增高59.5%(HepG2)和114.9%(HepG2/IR),并可在下调Bcl-2表达同时促进Caspase-3的活化,Bcl-2表达分别下调39.2%(HepG2)和 53.2%(HepG2/IR),而活化的 caspase-3 则分别上调 52.4%(HepG2)、67.7%(HepG2/IR)。自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)增强细胞自噬活性则发挥相反的作用。提示胰岛素抵抗肝癌细胞的高自噬活性是其药物耐受性的主要机制之一。3.HepG2细胞在胰岛素抵抗诱导过程中线粒体膜电位下降,并伴有活性氧产生增多,超微结构显示内质网扩张、脱颗粒并伴有线粒体肿胀。与亲本HepG2细胞相比较,HepG2/IR细胞的内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、XBP-1水平增高0.66-1.73倍,逆转细胞的胰岛素抗性可上述三种蛋白表达,使其降低至接近亲本细胞水平。应用RAPA增强自噬活性可降低内质网应激蛋白的水平,HepG2细胞分别降低29.9%(GRP78)、24.6%(XBP-1)和38.1%(pPERK/PERK),而HepG2/IR细胞则分别降低35.6%(GRP78)、33.0%(XBP-1)和46.0%(pPERK/PERK)。相反采用3-MA抑制自噬活性则可增高内质网应激反应相关蛋白的水平,HepG2细胞分别增高 48.1%(GRP78)、134.4%(XBP-1)、42.9%(pPERK/PERK),HepG2/IR细胞分别增高 43.2%(GRP78)、113.4%(XBP-1)和 22.4%(pPERK/PERK)。胰岛素抵抗诱导过程中HepG2细胞耐药蛋白P-糖蛋白表达逐渐增高0.34-1.37倍、外排功能增强,逆转胰岛素抗性可下调P-糖蛋白表达并削弱其外排能力。提示胰岛素抵抗细胞具有更高水平的自噬活性和内质网应激反应,且两者相互协同作用,以利于对细胞损伤的保护。结论:1.高浓度胰岛素诱导发生胰岛素抵抗的肝癌HepG2细胞对常规化疗药物的敏感性显著降低,细胞黏附、迁移及侵袭能力明显增强。2.胰岛素抵抗HepG2细胞具有较强的巨自噬和CMA活性,逆转胰岛素抵抗性可抑制细胞自噬活性;促进自噬活性可增强肝癌细胞对顺铂的耐受性,抑制自噬活性则增强细胞对顺铂的敏感性。3.胰岛素抵抗HepG2细胞具有更高水平的内质网应激反应且可被胰岛素增敏作用所逆转;增强/抑制胰岛素抵抗细胞的自噬活性则抑制/增强内质网应激反应,提示胰岛素抵抗肝癌细胞中自噬与内质网应激互为补充、协同发挥效应。4.肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗过程中P-gp的表达和功能均显著增强,且与细胞耐药性及内质网应激反应变化高度一致,提高胰岛素敏感性可抑制其表达和功能。提示P-gp是介导胰岛素抵抗肝癌细胞内质网应激反应和耐药性的重要因素。