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第一部分Piezo1介导机械牵张促进的肺支气管上皮细胞上皮-间质转化目的:研究机械牵张能否促进HCL刺激支气管上皮细胞上皮-间质转化,并探讨Piezo1在其中的关键作用。方法:选用人肺上皮细胞系（BEAS-2B细胞）作为研究对象。40mM HCl（培养液PH=4.0）刺激BEAS-2B细胞30min,以模拟临床误吸导致的ARDS。应用FX-4000细胞牵张加载系统对BEAS-2B细胞施加48h,幅度为20%,频率0.33Hz的牵张刺激,以模拟临床患者机械通气过程。本部分实验共分为A、B、C三个部分。A部分探究机械牵张能否引起BEAS-2B细胞上皮-间质转化。实验分组:（1）PBS+静止组（PBS+Static组）;（2）HCL+Static组;（3）PBS+牵张组（PBS+Stretch组）;（4）HCL+牵张组（HCL+Stretch组）。实验结束后,用倒置光学显微镜观察BEAS-2B细胞形态变化;ELISA法检测细胞上清中Hyp及TGF-β1含量;Western Blot法及细胞免疫荧光法检测细胞上皮细胞标志物Cytokeratin-8和E-cadherin以及间质细胞标志物α-SMA及Vimentin表达变化情况。B部分探究Piezo1在BEAS-2B细胞中的表达分布情况。Q-PCR法检测BEAS-2B细胞中机械牵张敏感蛋白Piezo1、Piezo2、TRPV4、TRPA1、TRPC3、TRPC6、KCNK4及stoml3的m RMA相对含量;细胞免疫荧光观察Piezo1在BEAS-2B细胞中的表达分布情况。C部分研究敲除Piezo1是否影响机械牵张促进的BEAS-2B细胞上皮-间质转化过程。利用CRISPR/Cas9系统构建Piezo1敲除的BEAS-2B细胞系（Piezo1-KO）。实验分为2个组:（1）WT+牵张组（WT+Stretch组）:BEAS-2B细胞转用HCL处理30min后,再用机械牵张48h;（2）Piezo1-KO+牵张组（Piezo1-KO+Stretch组）:敲除Piezo1的BEAS-2B细胞,HCL处理30min后,再用机械牵张48h。实验结束后,用倒置光学显微镜观察BEAS-2B细胞形态变化;ELISA法检测培养上清中Hyp及TGF-β1含量;Western Blot法及细胞免疫荧光法检测细胞上皮细胞标志物Cytokeratin-8和E-cadherin以及间质细胞标志物α-SMA及Vimentin表达变化情况。结果:A部分结果显示,（1）PBS+Static组细胞呈卵圆形,细胞存在极性。HCL+Static组细胞稍变长。PBS+Stretch组细胞变化不明显。HCL+Stretch组变为长梭形,极性消失。（2）同PBS+Static组比较,单独用HCL或Stretch处理细胞,细胞上清液中Hyp及TGF-β1水平稍有增加;同HCL+Static组比较,HCL+Stretch组细胞上清液中Hyp及TGF-β1水平显著增加（均P<0.05）。（3）单独用HCL或Stretch处理细胞,上皮细胞标志物E-cadherin和Cytokeratin-8表达稍下降,间质细胞标志物α-SMA及Vimentin表达稍增加;HCL与Stretch联合处理可以显著增强上述改变（均P<0.05）。B部分结果显示,（1）在BEAS-2B细胞中,机械牵张敏感蛋白Piezo1m RNA表达显著高于Piezo2m RNA（P<0.01）、TRPV4m RNA（P<0.05）、TRPA1m RNA（P<0.01）、TRPC3m RNA（P<0.01）、TRPC6m RNA（P<0.01）、KCNK4m RNA（P<0.01）及stoml3m RNA（P<0.01）。（2）在BEAS-2B细胞中,Piezo1主要表达于细胞膜中,少部分表达于细胞质中,细胞核中不表达。C部分结果显示,与WT+Stretch组相比,（1）Piezo1-KO+Stretch组细胞为卵圆形,细胞极性存在。（2）Piezo1-KO+Stretch组细胞上清液中Hyp（P<0.001）及TGF-β1（P<0.01）水平明显降低.（3）Piezo1-KO+Stretch组细胞上皮细胞标志物E-cadherin（P<0.01）和Cytokeratin8（P<0.01）表达明显升高,间质细胞标志物α-SMA（P<0.05）及Vimentin（P<0.01）表达明显降低。结论:机械牵张可以促进HCL刺激的BEAS-2B细胞发生上皮-间质转化。机械牵张敏感蛋白Piezo1在机械牵张促进BEAS-2B细胞上皮-间质转化中具有关键作用。第二部分Piezo1通过介导Ca2+内流及ATP释放调控机械牵张促进的肺支气管上皮细胞上皮-间质转化目的:研究Piezo1介导的Ca2+内流及ATP释放在机械牵张促进肺支气管上皮细胞上皮-间质转化中的作用。方法:实验共分为A、B、C、D及E五个部分。A部分研究Piezo1激动剂Yoda1对BEAS-2B细胞内Ca2+浓度及ATP释放的影响。实验分为6个组:（1）WT+DMSO组;（2）WT+Yoda1组;（3）WT+Gsmtx4+Yoda1组;（4）WT+EGTA+Yoda1组;（5）Piezo1-KO+DMSO;（6）Piezo1-KO+Yoda1组。采用Fluo3-AM荧光染色法检测细胞内Ca2+流及Ca2+浓度。分别于0min,5min,15min,30min及45min检测细胞上清ATP含量。B部分研究机械牵张对BEAS-2B细胞内Ca2+浓度及ATP释放的影响。实验分为6个组:（1）WT+DMSO组;（2）WT+Stretch组;（3）WT+Gsmtx4+Stretch组;（4）WT+EGTA+Stretch组;（5）Piezo1-KO+DMSO;（6）Piezo1-KO+Stretch组。采用Fluo3-AM荧光染色法染色BEAS-2B细胞并结合流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度。分别于0min,5min,15min,30min及45min检测细胞上清ATP含量。C部分研究Piezo1介导的胞外Ca2+内流对机械牵张刺激导致的BEAS-2B细胞ATP释放的影响。实验分为6个组:（1）WT+DMSO组;（2）WT+Stretch组;（3）BAPTAAM+Stretch组;（4）KO+DMSO组;（5）KO+Stretch组;（6）KO+BAPTA-AM+Stretch。于45min时检测细胞上清ATP含量。D部分研究外源性ATP对BEAS-2B细胞上皮-间质转化中的作用。实验分为4个组:（1）PBS组;（2）ATP组;（3）HCL组;（4）HCL+ATP组。实验结束后,用倒置光学显微镜观察BEAS-2B细胞形态变化;ELISA法检测培养上清中Hyp及TGF-β1含量;Western Blot法及细胞免疫荧光法检测细胞上皮细胞标志物Cytokeratin-8和E-cadherin以及间质细胞标志物α-SMA及Vimentin表达变化情况。E部分研究Piezo1介导的胞外ATP释放在机械牵张促进的BEAS-2B细胞上皮-间质转化中的作用。实验分为3个组:（1）HCL+静止组（HCL+Static组）;（2）HCL+牵张组（HCL+Stretch组）;（3）HCL+牵张+Apyrase组（HCL+Stretch+Apyrase组）。实验结束后,用倒置光学显微镜观察BEAS-2B细胞形态变化;ELISA法检测细胞上清中Hyp及TGF-β1含量;Western Blot法及细胞免疫荧光法检测细胞上皮细胞标志物Ecadherin和Cytokeratin-8以及间质细胞标志物α-SMA及Vimentin表达变化情况。结果:A部分结果显示,（1）BEAS-2B细胞在Yoda1（25μM）刺激后可导致胞内Ca2+浓度升高;（2）应用Gsmtx4或敲除Piezo1后胞内Ca2+升高程度显著降低;（3）采用了钙离子螯合剂EGTA螯合胞外Ca2+后可以明显抑制Yoda1导致的胞内Ca2+升高;（4）BEAS-2B细胞在Yoda1（2.5μM）刺激后可导致胞外ATP升高;（5）应用GSmtx4或敲除Piezo1后Yoda1导致的胞外ATP升高被显著抑制。B部分结果显示,（1）BEAS-2B细胞在Stretch刺激后可导致胞内Ca2+浓度升高;（2）应用GSmtx4或敲除Piezo1后胞内Ca2+升高程度显著降低;（3）采用了Ca2+螯合剂EGTA螯合胞外Ca2+后可以明显抑制机械刺激导致的胞内Ca2+升高;（4）BEAS-2B细胞在Stretch刺激后可导致胞外ATP升高;（5）应用Gsmtx4或敲除Piezo1后Stretch刺激导致的胞外ATP升高被显著抑制。（6）采用了Ca2+螯合剂EGTA螯合胞外Ca2+后可以明显抑制Stretch刺激导致的胞外ATP水平升高（P<0.01）。C部分结果显示,采用BAPTA-AM迅速鳌合胞内Ca2+后,可以显著抑制机械刺激导致的胞外ATP释放（P<0.001）,而对机械刺激导致的Piezo1敲除细胞ATP释放无明显影响。D部分结果显示,（1）同PBS组比较,ATP组细胞上清中胞Hyp及TGF-β1产生无明显变化,HCL组细胞上清中Hyp（P<0.05）及TGF-β1（P<0.01）产生稍有增加;与HCL组相比,ATP+HCL组Hyp及TGF-β1产生量明显增加（P<0.001）。（2）同PBS组比较,ATP组BEAS-2B细胞上皮细胞标志物E-cadherin和Cytokeratin-8表达及间质细胞标志物α-SMA及Vimentin表达无明显变化;HCL组BEAS-2B细胞E-cadherin和Cytokeratin-8表达稍降低,间质细胞标志物α-SMA及Vimentin稍升高;与HCL组相比,ATP+HCL组BEAS-2B细胞E-cadherin和Cytokeratin-8表达显著降低,间质细胞标志物α-SMA及Vimentin显著升高（P<0.05）。E部分结果显示,（1）与Static组比较,Stretch组细胞上清液中Hyp（P<0.0001）及TGF-β1（P<0.001）表达水平明显升高。与Stretch组相比,Stretch+Apyrase组胞上清液中Hyp（P<0.001）及TGF-β1（P<0.01）表达水平明显降低。（2）与Static组比较,Stretch组BEAS-2B细胞E-cadherin和Cytokeratin-8表达降低,间质细胞标志物α-SMA及Vimentin升高;与Stretch组相比,Stretch+Apyrase组BEAS-2B细胞E-cadherin和Cytokeratin-8表达显著升高,间质细胞标志物α-SMA及Vimentin表达显著降低（均P<0.05）。结论:Piezo1通过介导Ca2+内流及ATP释放调控机械牵张促进的上皮-间质转化。第三部分Piezo1介导机械通气促进的ARDS相关肺纤维化目的:研究Piezo1在机械通气促进的ARDS相关肺纤维化的作用。方法:采用气管滴注HCL（PH=1.2,2ml/kg）的方法构建小鼠ARDS模型。小动物呼吸机型机械通气2h（吸气峰压=22 cm H2O,PEEP=2cm H2O,呼吸频率=70次/分）模拟临床患者机械通气过程。实验分为A、B、C三个部分。A部分研究机械通气能否引起小鼠肺上皮-间质细胞转化及肺纤维化的发生发展。SPF级健康雄性C57BL/6小鼠随机分成4组:（1）Control组:小鼠经口气管插管滴入PBS,48h后经口气管插管,不进行通气;（2）HCL组:小鼠经口气管插管滴入HCL,48h后经口气管插管,不进行通气;（3）MV组:小鼠经口气管插管滴入PBS,48h后经口气管插管进行机械通气2h;（4）HCL+MV组:小鼠经口气管插管滴入HCL,48h后经口气管插管进行机械通气2h。机械通气14天后处死小鼠、收集肺组织。行HE染色和Masson染色评估小鼠肺损伤及肺纤维化程度。检测肺组织中COL-1、Hyp及TGF-β1的水平变化。应用Western blot及免疫荧光染色法检测上皮细胞标志物Ecadherin和Cytokeratin表达,间质细胞标志物α-SMA及Vimentin表达。B部分研究Piezo1在小鼠肺组织中的表达分布情况。免疫荧光检测Piezo1在小鼠肺组织中的表达分布。C部分研究敲低Piezo1能否减轻机械通气促进的ARDS相关肺纤维化。使用腺相关病毒载体（AAV,Adeno-associated virus）转染的方法敲低肺组织Piezo1表达。然后实验分为4组:（1）Sc RNA转染组:Sc RNA转染小鼠经口气管插管滴入HCL,48h后经口气管插管,不进行通气;（2）Sh RNA转染组:Sh RNA转染小鼠,经口气管插管滴入HCl,48h后经口气管插管,不进行通气;（3）Sc RNA转染+MV组:Sc RNA转染小鼠经口气管插管滴入HCl,48h后经口气管插管行机械通气2 h:（4）Sh RNA转染+MV组:Sh RNA转染小鼠,经口气管插管滴入HCl,48h后经口气管插管行机械通气2h。14天后处死小鼠、收集肺组织。HE染色及Masson染色评估肺损伤程度及肺组织胶原纤维沉积;检测肺组织COL-1、Hyp及TGF-β1水平;应用Western blot及免疫荧光染色法检测上皮细胞标志物E-cadherin和Cytokeratin-8表达,间质细胞标志物α-SMA及Vimentin L表达。结果:A部分结果显示:与Control组相比,（1）HCL组及MV组小鼠肺损伤程度,肺组织损伤程度、蓝色胶原沉积,COL-1水平、Hyp水平及TGF-β1水平明显增加。（2）上皮标志物E-Cadherin、Cytokeratin-8表达较对照组明显下调,间质标志物α-SMA与Vimentin表达明显升高。（3）HCL与MV联合应用会进一步促进这些改变。B部分结果显示:Piezo1广泛表达于肺组织上皮细胞。在肺上皮细胞中,Piezo1主要表达于细胞膜,胞质中少量表达,细胞核无表达。C部分结果显示:与Sc RNA+MV相比,（1）Sh RNA+MV组小鼠肺损伤程度（P<0.05）,蓝色胶原沉积（P<0.05）,COL-1水平（P<0.05）,Hyp（P<0.05）及TGF-β1（P<0.01）水平明显降低。（2）上皮标志物E-Cadherin、Cytokeratin-8表达明显上调,间质标志物Vimentin与α-SMA表达明显降低（均P<0.05）。结论:机械通气可以加重ARDS相关肺纤维化。机械牵张敏感蛋白Piezo1在机械牵张加重ARDS相关肺纤维化中具有关键作用。