研究背景及目的胆汁淤积(cholestasis)是多种疾病和生理状态所致的常见临床综合症,其病因包括如：(病毒性和非病毒性)肝炎(hepatitis)、肝硬化(liver cirrhosis)、脂肪肝(fatty liver)、感染(infection)、胆道阻塞(bile duct obstruction)、遗传病(genetic diseases)、孕娠(pregnant)等。在胆汁淤积状态下,肝细胞内不断积聚的毒性胆汁酸(toxic bile acids)造成肝脏损伤,激发肝脏产生适应性反应(Adaptive responsive),即胆汁酸代谢基因表达发生适应性改变：(1)Phase 0(摄入)相Ntcp、Oatps等表达下降,减少胆汁酸向肝细胞内泵入；(2)Phase Ⅰ(合成)相Cyp7a1、Cyp8b1等胆汁酸合成相关的酶类表达下调,减少肝细胞内胆汁酸的生成；(3)Phase Ⅱ(解毒)相Ugts、 Sults、 Gsts等胆汁酸硫酸化、葡萄糖苷化、谷胱甘肽化有关的酶表达增强,从而增加胆汁酸的水溶性、降低胆汁酸的毒性；(4)Phase Ⅲ(排泌)相的胆酸相关转运蛋白Mrp3、Mrp、Ostα/β的表达显著上调,增强肝细胞内胆汁酸的排泌,减少毒性胆汁酸在肝细胞内的积聚。然而,目前对于胆汁淤积适应性反应的分子机制的认知,主要来源于动物实验或体外细胞培养。由于活体动物、体外细胞培养的环境均与人体存在显著差异。因此,对于阻塞性胆汁淤积下肝脏是否产生适应性反应以及其具体的分子机制尚不清楚。尤其值得注意的是胆酸转运蛋白MRP2/ABCC2,其定位表达于肝细胞胆管面膜,主要排泌结合胆红素、胆汁酸等有机阴离子化合物。但是,MRP2单基因缺失或突变会导致以高胆红素血症和胆汁酸增高为主要症状的Dubin-Jonhson综合征[。因此,MRP2在胆汁淤积发生、发展中功能极其重要。近期文献报道,雌激素诱导的胆汁淤积大鼠肝脏Mrp2 mRNA和总蛋白水平表达无明显变化,而肝细胞胆管面膜Mrp2表达显著减少。前期研究也表明,阻塞性胆汁淤积下肝脏MRP2 mRNA表达也无明显变化。因此,我们推测阻塞性胆汁淤积下肝脏MRP2蛋白表达减少可能为转录后调控。有动物实验研究表明,细胞骨架蛋白Radixin基因缺失会导致小鼠肝细胞胆管面膜Mrp2表达缺失,从而引起高胆红素血症。有细胞水平实验研究表明,Radixin和Ezrin基因敲减可显著减少人肠上皮细胞株Caco2细胞膜上的MRP2蛋白的表达。此外,Ezrin Thr567磷酸化与大鼠肠道上皮细胞顶膜MRP2蛋白定位表达密切相关,而且PKCa具有决定其表达定位的作用。并且,胆汁淤积动物模型肝脏PKC被活化,能够在不影响肝脏MRP2 mRNA表达的情况下而减少肝细胞膜上MRP2蛋白的表达。最新研究表明,蛋白激酶C (PKC)可诱导乳腺癌细胞株MCF-7的Ezrin Thr567磷酸化[24]。因此,我们提出人阻塞性胆汁淤积下肝脏MRP2转录后调控的分子机制假设：阻塞性胆汁淤积时,肝脏蛋白激酶PKC被活化,诱导骨架蛋白Ezrin Thr567磷酸化,促使肝细胞胆管面膜MRP2内吞,最后经由蛋白酶体降解途径(ERAD)降解。在本研究中,我们收集人阻塞性胆汁淤积组和正常对照组病人肝脏组织,运用Realtime qPCR(SYBR)、 Western-blot、免疫共沉淀、免疫荧光、免疫组化、稳定转染细胞株等技术,阐明人阻塞性胆汁淤积肝脏的适应性反应以及验证MRP2转录后下调的分子机制假设。研究方法1.收集人阻塞性胆汁淤积组和正常对照组肝脏组织,一部分用4%多聚甲醛固定；一部分剪成小块后,冻存于液氮罐保存,用于总RNA、总蛋白、总膜蛋白、核蛋白等提取。2. Real time qPCR(SYBR)检测阻塞性胆汁淤积组、对照组肝脏胆汁酸合成酶(CYP7B1、CYP8B1、CYP27A1),肝脏解毒酶(UGT2B4/7、SULT2A1、GSTA1-4、 GSTA1-5、肝细胞基底侧膜胆酸转运蛋白(OSTα/β、OCT1)、肝细胞胆管面膜转运蛋白(ABCG2、ABCG5/8)以及调节相关核受体(VDR、PPARα、HNF1α、HNF4α、RXRα) RARα、LXR、FXR、SHP)和核转录因子(NF3β、NRF2β、AHR)的mRNA水平的表达情况。3. Western-blot检测上述基因在阻塞性胆汁淤积组和正常对照组的蛋白表达水平。4.免疫荧光检测胆酸转运蛋白OSTα/β、OCT1、ABCG2、ABCG8和核受体VDR、HNF4α、RARα、FXR在阻塞性胆汁淤积组和正常对照组的蛋白表达定位情况。5. Real time qPCR(SYBR)检测阻塞性胆汁淤积组、对照组肝脏骨架蛋白(Ezrin、 Radixin)、蛋白激酶C(PKCα、PKCδ、PKCε)、泛素连接酶E3s(gp78、TEB4、HRD1)的mRNA水平的表达情况。6. Western-blot检测上述基因在阻塞性胆汁淤积组、对照组的蛋白表达情况。同时还检测,Ezrin Thr567磷酸水平的情况。7.免疫荧光和免疫组化检测MRP2、Ezrin、磷酸化Ezrin Thr567在阻塞性胆汁淤积组、对照组肝脏表达定位情况。8.通过免疫共沉淀技术,研究Ezrin(磷酸化Ezrin Thr567)、Radixi、PKCα、PKCδ PKCε、 MRP2泛素化之间的相互作用。9.构建Ezrin野生型及突变体、PKCa野生型及突变体等HepG2稳定转染细胞株后,通过Real time qPCR、Western-blot等检测其mRNA、总蛋白、总的膜蛋白和生物素标记的膜蛋白的MRP2表达情况。结果1.阻塞性胆汁淤积下胆汁酸合成经典途径(CYP7A1)被抑制；而替代途径(CYP7B1、CYP8B1)被激活。2.阻塞性胆汁淤积下肝脏解毒酶UGT2B、SULT2A1、GSTA1-4、GSTM1-4蛋白表达显著减少。3.阻塞性胆汁淤积下肝细胞基底侧膜OSTβ、OCT1表达显著增高、OSTα蛋白表达明显减少；胆管面膜ABCG2、ABCG8表达显著减少。4.阻塞性胆汁淤积下肝脏核受体FXR表达显著减少；VDR、RARα、HNF4α表达显著增加。5.阻塞性胆汁淤积下核受体FXR表达显著减少,与肝脏解毒酶UGT2B、SULT2A1、GSTA1的表达减少存在显著正相关。6.阻塞性胆汁淤积下肝细胞胆管面膜MRP2表达显著减少；总蛋白MRP2表达也明显减少。7.阻塞性胆汁淤积下肝细胞骨架蛋白Radixin和Ezrin表达无明显变化。但是,EzrinThr567磷酸化水平在胆汁淤积肝脏显著增高,其脱磷酸化可影响Ezrin与MRP2蛋白间的相互作用。在HepG2稳定转染细胞株水平,Ezrin Thr567磷酸化可明显减少肝细胞膜MRP2的表达。8.阻塞性胆汁淤积下PKC在mRNA和蛋白水平表达显著增加。而通过肝脏组织样品和细胞水平的实验证明,PKCa可诱导Ezrin Thr567磷酸化,同时减少肝癌细胞HepG2细胞膜上MRP2的表达。9.阻塞性胆汁淤积下泛素连接酶E3 gp78表达和MRP2泛素化明显增加。在HepG2稳定转染细胞株,gp78干扰后可增强总蛋白MRP2的表达。结论通过本研究表明,阻塞性胆汁淤积时,肝脏产生自我保护、适应性反应,一方面激活胆汁酸替代途径(如CYP7B1、CYP8B1增高),另一方面增强肝细胞内胆汁酸排泌(如OSTβ增高),减轻肝脏损伤。但是,由于肝脏解毒酶(如UGT2B、SULT2A1、GSTA1)的表达显著降低,从而消弱了适应性反应的效果。我们通过分析发现,阻塞性胆汁淤积下肝脏核受体FXR的减少与肝脏解毒酶表达(如UGT2B、SULT2A1、GSTA1)降低存在显著正相关。这提示,FXR在阻塞性胆汁淤积下肝脏解毒功能消弱发挥重要的作用。而且,这也能很好的解释,FXR激动剂(如UDCA、INT747)为何具有减轻胆汁淤积病人肝损伤的效果。此外,我们通过研究还发现,阻塞性胆汁淤积下肝脏MRP2表达下调为转录后调控,其可能的分子机制：首先,蛋白激酶PKC(PKCα、PKC8、PKCε)表达增高和激活；其次,PKC诱导Ezrin Thr567发生磷酸化,从而增强Ezrin与肝细胞胆管面膜MRP2的蛋白间相互作用；然后,磷酸化的Ezrin Thr567促使细胞胆管面膜MRP2内吞；最后,内吞至肝细胞内的MRP2蛋白经由泛素连接酶E3 gp78介导的蛋白酶体降解途径降解。理解和弄清楚胆汁淤积表达下调的分子机制具有极其重要的意义,不仅仅可加深我们对胆汁淤积发生、发展的分子机制的理解,而且也能为我们研发新的治疗药物和靶向治疗提供了新的重要线索。