多能性干细胞对畜牧业发展和医学研究具有重要意义。兔作为传统的试验动物，被广泛地应用于转基因动物和人类疾病研究。兔的多能性干细胞—胚胎干细胞（Embryonic stem cell, ESC）和诱导性多潜能干细胞（Induced pluripotent stem cell, iPSC）研究仍处于初级阶段，分离培养及鉴定方法还需要进一步探索。为完善兔多能性干细胞的研究方法，本试验分离培养了日本大耳白兔的类ESC，进行了多能性鉴定，同时初步探索了将兔胎儿成纤维细胞（Rabbit embryo fibroblast, REF）诱导为iPSC的方法。研究结果如下：　　1、分离得到了兔类ESC：使用FSH和hCG结合的方法对60只母兔进行超排，交配96 h后冲取胚胎，平均每只母兔可得38枚胚胎，囊胚率为79.96％。选用76%Knockout DMEM+20%KSR+1%谷氨酰胺+1%NEAA+1%β-巯基乙醇+1%青链霉素+10 ng/mL bFGF+1000 IU/mL hLIF作为兔类ESC基础培养液，并在基础培养液中添加不同浓度的褪黑素（10-6，10-7，10-8，10-9，0 M），探索褪黑素对兔囊胚、内细胞团（Inner cell mass, ICM）、ESC生长增殖的影响。试验结果表明，添加褪黑素对兔囊胚的贴壁率没有显著影响，5组囊胚贴壁率均在50%左右，但对ICM和类ESC的增殖、传代有促进作用，其中褪黑素浓度为10-7 M时作用最为显著。10-7 M的褪黑素可以显著提高ICM的增殖率（P<0.05），由19.97%提升到34.57%。对ICM进行机械传代，可以得到形态扁平，有清晰边缘的兔类ESC克隆。添加10-7 M褪黑素可以将兔类ESC的传代数由4代提高到6代，并且能够显著提高第4和第6代的传代率（P<0.05）。　　2、对P5代兔类ESC进行鉴定，试验结果表明，兔类ESC具有多能性：兔类ESC克隆碱性磷酸酶染色为阳性；RT-PCR可以检测到多能性基因Oct4，Sox2，Klf4, c-Myc, Nanog, Line28a的表达；qPCR检测结果表明，多能性基因Oct4，Sox2，Nanog的表达量明显高于兔胎儿成纤维细胞；免疫荧光染色结果表明，多能性标志蛋白OCT4，SOX2，NANOG为阳性，胚胎干细胞表面标记蛋白SSEA-1，SSEA-4和TRA-1-60，TRA-1-81为阳性，其中SSEA-4和TRA-1-60微弱表达；核型正常为2n=44；去除饲养层和多能性维持因子后，兔类ESC可自然分化为脂肪样细胞、神经样细胞、成纤维样细胞和跳动的心肌细胞；悬滴培养8 d后可以形成拟胚体，分化14和21 d后，qPCR和免疫荧光检测结果表明，组织特异性基因 Bmp4，Afp，Desmin，Sox17，Pax6和组织特异性蛋白VIMENTIN，β-TUBULIN，AFP，ALB，DESMIN的表达量随分化时间延长而升高，说明兔类ESC可以向神经、成纤维、肝脏、肌肉等细胞分化。将第3代兔类ESC注射到NOD-SCID小鼠腹股沟皮下，8周后可以形成具有神经、肌肉、腺体等三胚层组织的畸胎瘤。　　3、探索了将兔胎儿成纤维细胞诱导为 iPSC的方法：使用含有人源转录因子 Oct4，Sox2， Klf4，c-Myc的逆转录病毒载体感染原代兔胎儿成纤维细胞。感染后12-18天获得了3种类型的细胞克隆，形成率分别为0.01%，0.03%和0.06%。其中第2种克隆可以稳定传代。机械法传至第10代后外源基因不沉默，第10代克隆AP染色为阴性，表明没有获得兔iPS细胞系。