病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)是由多种病毒感染引起的以心脏组织弥漫性炎症细胞浸润和灶性心肌细胞坏死为特征的临床常见且发病逐年升高的心血管疾病,其在全球发病率约0.12%-12%,在我国约为2%-15%,且被显著低估。VMC的慢性化容易进展为致死性的扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)和心衰(HF),是导致青少年猝死、心脏移植的主要原因,目前没有对症治疗手段。阐明VMC的发病机制对于寻找临床防治VMC的诊疗新策略具有重要意义。VMC的致病原包括肠道病毒、腺病毒、流感病毒、细小病毒和巨细胞病毒等。其中肠道病毒属的B3型柯萨奇病毒(CVB3)所引起的VMC在心脏移植中最为常见,研究最为广泛。CVB3为单正链RNA病毒,通过粪口途径在胃肠道少量复制后,经血液循环感染心脏、胰腺、脑、肝脏、肺脏和脾脏等多器官,导致心肌炎、胰腺炎等多脏器疾病。CVB3感染雄性BALB/c小鼠可诱导与人类急性、慢性VMC类似的心肌炎症疾病,分为三个阶段:1)急性病毒期(0-4~7天),病毒直接感染心肌细胞,第3天复制达高峰,大量心肌细胞裂解导致灶性坏死,多种固有免疫细胞如单核细胞、gdT、NK细胞陆续浸润心脏,产生炎症细胞因子如IL-1b,IL-6,IL-18,TNF-a,及I型干扰素,趋化更多固有免疫细胞和T细胞等进入心脏;2)亚急性免疫期(7天-数周),病毒复制水平降至本底,机体启动适应性免疫,T细胞浸润在第7-14天达高峰,以Th1/Th17亚型为主,并可诱导自身抗体攻击心脏组织,释放更多的炎症信号和损伤信号;心肌损伤及炎性浸润均达到高峰。3)慢性心肌病期(数月至数年),宿主免疫系统启动心肌修复与重构,但病毒的低水平持续存在和机体Th2型免疫促进心肌纤维化及心脏收缩功能受损,最终导致慢性扩张型心肌病和心衰。目前认为:CVB3的复制是导致最初期灶性心肌细胞坏死的主要原因,但随后出现的急性和慢性心肌炎,主要由病毒诱导的炎症细胞心脏浸润所介导,其中固有免疫与适应性免疫均发挥重要作用。以往对于Th1、Th17、Treg等适应性免疫在VMC发病中的作用及机制研究较为充分,有关固有免疫在VMC发病中的作用日益受到重视。固有免疫是机体抗感染的第一道防线。位于机体黏膜及与外界交流的界面附近的固有免疫细胞,通过细胞表面或胞浆的多种模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)如Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)等,识别病原体所共有的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),激活特定的固有免疫信号通路,通过合成I型干扰素、多种炎症细胞因子和上调抗原提呈细胞的APC功能来参与对病原体感染的快速控制。在病毒性心肌炎早期,心脏浸润的固有免疫细胞包括NK、gdT、巨噬细胞等,发挥分泌IFNg、IL-17等炎症因子、直接抗病原体或者间接调控适应性T细胞应答的多种重要功能。在CVB3诱导的VMC中,我们特别关注了目前研究较少的中性粒细胞这一固有免疫细胞,其原因在于:1)中性粒细胞是公认的在细菌、真菌急性感染期由外周血快速动员到达感染部位清除感染的重要细胞,在脓毒血症等急性炎症性疾病中发挥重要功能;2)目前仅有少数中性粒细胞抗病毒功能的研究,有报道人类呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒(HSV)感染中,中性粒细胞在呼吸道和肺脏的大量浸润(约占浸润淋巴细胞总数的80%)与迁延,与呼吸道炎症损伤密切相关;3)中性粒细胞占人外周血淋巴细胞70%,提示其可作为病毒入血感染脏器的首要监视细胞;4)中性粒细胞被报道可分泌TNFa等促炎细胞因子、反应性氧中间物(ROS)和多种天然抗菌肽,上述效应因子具有广泛的抵抗病原体和调节免疫细胞功能作用;5)中性粒细胞在感染及组织损伤情况下,会自发凋亡形成一种以细胞DNA、组蛋白、多种抗菌肽和细胞骨架所组成的细胞外诱捕网(NET)结构,用于限制和清除病原体或有害物质;6)中性粒细胞被报道与巨噬细胞组织浸润具有前后依赖和相互调节的特性;7)在目前研究较为详尽的心肌缺血和心肌梗塞疾病中,中性粒细胞也被证明最先到达损伤的心肌细胞,其浸润与心肌纤维化和功能丧失有密切关系。综上,我们推测中性粒细胞可能在CVB3感染心脏过程中发挥重要调控作用,其通过细胞表面PRRs识别CVB3的多种PAMP,发挥快速炎症调控和抗病毒直接作用。我们的预试验证实了CVB3感染后骨髓和外周血中性粒细胞迅速扩增、及其早达1.5天的快速心脏浸润,这一反应早于巨噬细胞等。同时,我们的预实验显示:CVB3复制在感染第3天达到高峰,心肌细胞的大量裂解将释放大量的细胞损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),作为损伤或危险信号,诱导修复。我们检测了DAMPs中的主要成员---高速迁移率族蛋白-1(high-mobility group box 1 protein,HMGB1)在CVB3感染早期的水平,发现小鼠心脏以及小鼠原代心肌细胞均在感染24小时显著上调HMGB1表达,并在第3天达到高峰。HMGB1的这一释放曲线与中性粒细胞的心脏早期浸润曲线非常一致。HMGB1通过与固有免疫细胞表面的TLR4相互作用,可促进炎症应答的发生。我们证实骨髓中性粒细胞表面确实表达HMGB1的受体TLR4等。上述背景提示:中性粒细胞在CVB3感染最早期(0-2天)浸润于心脏,其可能发挥重要的抗病毒作用和炎症调节作用。中性粒细胞除通过PRRs识别CVB3来源的PAMPs外,非常有可能通过PRRs识别与中性粒早期浸润心脏动力学高度一致的心肌细胞裂解释放的DAMP-----HMGB1,发挥重要的炎症调节功能。我们特别发现:中性粒细胞上高表达一类HMGB1的可能受体------髓系细胞触发受体-1(triggering receptors expressed on myeloid cells-1,TREM-1)。提示HMGB1/TREM-1axis可能是中性粒细胞在CVB3早期浸润心脏发挥功能的重要信号通路。综上,我们提出如下科学假设:在CVB3感染最早期(0-2天),中性粒细胞先于其他固有免疫细胞到达心脏组织,可能发挥直接抗病毒作用;而同期CVB3裂解心肌细胞使高水平HMGB1释放入心脏组织,这一DAMP信号可能被中性粒细胞所感知,通过HMGB1/TREM-1信号途径发挥炎症调控作用,影响急性VMC的进程。我们拟在CVB3感染BALB/c小鼠的急性VMC模型中,首先明确心脏浸润中性粒细胞的动态曲线;随后通过特异性中和抗体清除中性粒细胞,明确其在急性VMC中的抗病毒功能和免疫调节功能;为阐明中性粒细胞通过HMGB1/TREM-1通路发挥作用的机制,拟通过特异阻断试验和中性粒细胞体外干预并回输试验,直接和间接证实中性粒细胞的炎症调控作用和该作用发挥的HMGB1/TREM-1信号途径。本课题聚焦一类重要的但被低估的固有免疫细胞---中性粒细胞在急性VMC发病中的免疫调节作用,并阐明其经由HMGB1/TREM-1信号通路发挥促心肌炎和促病毒复制的创新分子机制。该研究未见报道。第一部分CVB3感染最早期心脏浸润的中性粒细胞在急性病毒性心肌炎中的重要促炎功能一、BALB/c小鼠病毒性心肌炎的建立CVB3感染雄性易感BALB/c小鼠建立的急性VMC动物模型与临床VMC病患特征非常相似。以1000TCID50效价的CVB3 100ul腹腔感染BALB/c雄鼠,发现感染第3天,病毒复制达峰值,小鼠开始死亡,至第7天,小鼠体重减轻率达20%,存活率50%-80%,心脏HE病理显示小鼠心脏有大量炎性细胞浸润、局灶性心肌细胞坏死。提示CVB3小鼠病毒性心肌炎模型成功建立。二、CVB3感染急性期骨髓和外周血中性粒细胞均大量扩增作为在急性细菌感染中发挥重要作用的中性粒细胞,其在病毒感染中的作用鲜有报道。为检测CVB3急性感染小鼠后的中性粒细胞的动力学改变,我们首先检测了CVB3感染0/3/7天骨髓和外周血中CD11b+Ly6G+中性粒细胞的比例和绝对数。结果发现:CVB3感染后,如同细菌急性感染诱导的中性粒细胞的快速动员,骨髓和外周血中的中性粒细胞比例均显著上调,而绝对数在感染第7天均显著增高了10倍以上,提示中性粒细胞在病毒感染后发生快速的动员与增殖。三、CVB3感染急性期心脏与脾脏均存在大量中性粒细胞浸润流式检测CVB3感染后小鼠心脏和脾脏中中性粒细胞的变化,发现:心脏中,感染1.5-3天,中性粒和单核细胞浸润显著增高,在1.5天达峰值,随后降低;而巨噬细胞、NK及γδT细胞则在0-3天过程中持续增高。感染36h,心脏浸润单核细胞数目约为中性粒细胞的2倍,两种细胞是心脏浸润最多数量的细胞。而在脾脏,感染0-3天,脾脏浸润各免疫细胞除单核外比例均显著增多,中性粒细胞比例持续增加(CD11b+细胞的14%-46%,1.5×105/脾脏/day3),其绝对数明显高于单核、巨噬细胞等。四、中和抗体清除试验评估中性粒细胞在CVB3病毒性心肌炎中的作用为了检测中性粒细胞在急性VMC发病中的作用,采用anti-Ly6G中和抗体特异性清除小鼠体内中性粒细胞,检测急性VMC的发病和病毒复制情况。结果发现:1)两次静脉注射中和抗体外周血中性粒细胞的清除效率高达95%;2)清除中性粒细胞可增加小鼠死亡率;3)清除中性粒细胞可显著减轻心脏炎性细胞浸润和局灶性坏死;4)脾脏浸润的CD11b+髓系细胞总数、中性粒细胞、单核细胞、CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞数目均显著降低;5)清除中性粒细胞对病毒复制影响不显著。提示:在VMC发病过程中,中性粒细胞的早期浸润通过放大炎症效应发挥促进病毒性心肌炎作用。综上,CVB3感染所介导的急性病毒性心肌炎期间,小鼠骨髓和外周血中性粒细胞快速扩增动员,中性粒细胞先于NK及γδT细胞浸润于心脏和脾脏,且其绝对数在第3-4天达到高峰,提示中性粒细胞在CVB3急性感染中发挥相当的作用。而清除试验证实中性粒细胞在CVB3感染中发挥促进炎症细胞心脏浸润和组织炎症损伤作用。HMGB1发挥促进心肌炎作用第二部分中性粒细胞通过感知心肌细胞释放的危险信号为阐明中性粒细胞是如何感知CVB3感染、从而最先浸润于心脏组织、并通过何种通路发挥促进心肌炎的有害作用,设想中性粒细胞不仅通过PRR识别病毒的PAMP,还可识别CVB3裂解心肌细胞释放的DAMP,来快速动员至心脏组织。高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)成为首先考虑的心肌细胞释放的DAMP。一、CVB3感染小鼠心肌释放高水平HMGB1的动力学在BALB/c小鼠急性VMC模型中,首先证实CVB3的载量和复制水平在第3-4天间达到高峰,第7天已降至极低水平。提示心肌细胞坏死高峰也在第3-4天。随后以Western-blot检测感染0-3-7天心脏的HMGB1蛋白水平。结果发现:CVB3感染后心脏HMGB1水平显著升高(p<0.05),并在第3天达到顶峰,随后下降至第7天达本底,显示与CVB3心肌细胞复制相一致的动力学。二、CVB3体外感染原代心肌细胞和巨噬细胞显著上调HMGB1的表达体外以CVB3感染乳鼠原代心肌细胞和Raw264.7巨噬细胞系,检测CVB3体外作用于心肌细胞的HMGB1的上调情况。结果表明:有本底表达的乳鼠原代心肌细胞在感染0-24小时HMGB1水平持续增高;CVB3作用Raw264.7细胞后6-24小时HMGB1表达水平显著升高。提示CVB3体内体外作用于心肌细胞和巨噬细胞,都显著促进危险信号分子HMGB1的表达和释放。三、以甘草皂苷阻断HMGB1体内作用研究对小鼠急性VMC发病的影响为了阐明心脏释放的HMGB1的作用,CVB3感染1h后,以HMGB1的药理学阻断剂甘草皂苷GZA每隔2天经腹腔注射连续3次,以阻断游离HMGB1功能。结果提示:以GZA阻断HMGB1的体内功能后,小鼠生存率显著升高,体重减轻率明显下降,心脏组织的CVB3病毒载量与复制均显著下降(p<0.05),与发生典型的急性VMC的PBS处理组小鼠相比,GZA处理小鼠心脏炎症浸润显著减少;流式检测外周血及脾脏髓系细胞比例发现:GZA处理小鼠脾脏CD11b+Ly6Chigh单核细胞和CD11b+Ly6G+中性粒细胞比例均显著降低;外周血单核细胞比例与数目均显著减少,但中性粒细胞无显著变化。提示阻断小鼠体内游离HMGB1的功能,可通过减少病毒复制、减少外周血单核细胞数目及其向心脏组织的浸润、中性粒细胞向心脏组织的浸润而显著减轻CVB3感染诱导的病毒性心肌炎。的影响四、提取中性粒细胞体外经HMGB1预刺激后回输小鼠对CVB3诱导心肌炎为证实CVB3裂解心肌细胞释放的大量HMGB1损伤信号是否可以被中性粒细胞所感知、应答并发挥炎症调控作用,我们优化了小鼠骨髓中性粒细胞的提纯(纯度达90%以上),以5*105数目的WT小鼠中性粒、CVB3感染小鼠中性粒、HMGB1蛋白预刺激4小时的WT小鼠中性粒细胞,经尾静脉输注感染CVB3 1天的小鼠,再检测心肌炎发病。结果发现:1)心肌炎:与单纯CVB3感染小鼠相比,WT中性粒细胞输注组小鼠生存率无显著改变,心肌炎症有少量增加;与WT中性粒相比,CVB3感染小鼠中性粒细胞回输组生存率显著下降(p<0.05)、体重显著减轻(p<0.05),心肌炎显著加重(p<0.05);提示CVB3感染小鼠中性粒细胞具有加重心肌炎的作用。而HMGB1预刺激的WT中性粒细胞回输小鼠,只有心脏炎症浸润与WT中性粒回输相比显著增加(p<0.05),与CVB3感染小鼠中性粒回输组结果相似。2)心脏病毒复制:与单纯CVB3感染相比,WT中性粒细胞回输组无显著差异;CVB3感染小鼠中性粒细胞回输组心脏复制显著升高(25倍,p<0.01);而HMGB1预刺激中性粒细胞回输组病毒复制虽不及感染小鼠中性粒细胞的强烈促病毒复制作用,但与其他组相比仍显著促进病毒复制(p<0.05)。提示:HMGB1蛋白可活化中性粒细胞的促炎和促进病毒复制功能,可产生与CVB3感染中性粒细胞相接近的功能。3)脾脏淋巴细胞亚群:与正常小鼠相比,CVB3感染小鼠脾脏淋巴细胞比例与绝对数均显著增加;与单纯CVB3感染小鼠相比,WT中性粒细胞回输组无显著差异;而与之相比,CVB3感染小鼠中性粒细胞回输组几乎所有髓系细胞和淋巴细胞均显著地减少(p<0.01),特别是中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、CD4+T细胞和gdT细胞。提示感染小鼠的中性粒细胞具有促进脾脏病毒复制、导致各免疫细胞减少。而HMGB1蛋白预刺激WT中性粒细胞回输组,则与CVB3感染小鼠中性粒细胞回输组的效果几乎一致,即通过促进病毒复制显著摧毁免疫细胞。4)外周血免疫细胞亚群:改变与脾脏的趋势一致。综上,CVB3早期感染大量裂解心肌细胞,3天时释放高水平HMGB1,这一DAMP可被此时最先浸润的中性粒细胞所感知,通过特定信号通路激活放大炎症功能和促进病毒复制功能,使中性粒细胞心脏浸润呈现显著的促炎和促进病毒复制作用第三部分中性粒细胞通过TREM1-HMGB1通路促进CVB3诱导的急性病毒性心肌炎参与识别结合HMGB1的受体主要有识别病原体PAMP的PRR如TLR2/4/9和糖基化终产物受体(RAGE)等。我们发现,HMGB1可能与一种非TLRs、非RAGE的新受体----髓系细胞触发受体-1(TREM-1)相互结合发挥功能。TREM-1目前认为在细菌急性感染中具有放大炎症的功能。本部分我们进一步研究中性粒细胞表面的TREM1是否可被CVB3所显著上调,这一TREM1-HMGB1通路的激活究竟诱导了中性粒细胞的什么活性、并如何参与心肌炎的炎症放大作用?一、中性粒细胞经CVB3感染后的TREM-1受体表达水平最为显著上调实时定量PCR分析BALB/c小鼠骨髓来源中性粒细胞表面HMGB1受体TLR4和RAGE的本底表达。结果发现:中性粒细胞几乎不表达RAGE,TLR4本底表达显著高于RAGE,而以CVB3感染3天小鼠心脏匀浆液体外刺激中性粒细胞,发现TLR4显著上调。而后检测了HMGB1的另一可能受体-----TREM-1的表达,发现生理状况下,TREM1本底表达显著高于TLR4;而在感染3天心脏匀浆液刺激后TREM1表达进一步显著增高(p<0.05,近3倍),成为中性粒细胞上水平最高的HMGB1受体。提示坏死心肌细胞释放的HMGB1,可被中性粒细胞高表达的TREM-1受体识别。二、VMC小鼠心脏中TREM-1表达水平的动力学为检测小鼠急性VMC期心脏组织TREM-1的表达水平,实时定量PCR检测CVB3感染心脏组织RNA。发现:本底很低的TREM-1水平显著升高,在第6天达高峰(10倍,p<0.05)。通过流式检测分析心脏浸润的中性粒细胞、单核及巨噬细胞表面的TREM-1水平,发现:感染后第3天,心脏浸润的单核、巨噬和中性粒细胞均显著增多;且表面的TREM-1水平均显著升高,中性粒细胞和单核细胞表面的TREM1水平高于巨噬细胞。三、si RNA下调TREM-1对细胞产生炎性因子的影响首先构建了TREM-1 si RNA,可显著下调细胞中70%以上TREM-1的表达。为检测TREM1介导的固有免疫细胞炎症因子分泌的影响,首先TREM-1 si RNA转染Raw264.7细胞36小时,随后以CVB3(MOI=10)作用,RT-PCR检测炎症细胞因子的水平,结果发现:TREM-1表达显著降低,导致IL-1β和IL-6的分泌显著降低,但TNFa变化不大。提示巨噬细胞表面的TREM-1在CVB3感染中有促进炎症细胞因子分泌作用。四、HMGB1-TREM1通路介导的中性粒细胞释放抗菌肽、NET、炎症功能为探讨HMGB1对于中性粒细胞的直接效应,取正常小鼠骨髓中性粒细胞,体外加入CVB3病毒、HMGB1或CVB3感染3天小鼠心脏匀浆液,以荧光抗体染色(DAPI、anti-Ly6G)检测观察是否出现细胞外诱捕网(NET)结构,结果尚不理想。同时检测细胞上清中抗菌肽CRAMP、S100A8/A9的表达,结果尚在进行中。以重组HMGB1或CVB3感染3天小鼠心脏匀浆液刺激小鼠骨髓中性粒细胞,发现:HMGB1或CVB3感染3天小鼠心脏匀浆液可显著促进中性粒细胞分泌IL-17A、TNFa、IFNg和中性粒细胞趋化因子CXCL1等;提示中性粒细胞体外经损伤信号DAMP刺激,可显著增高炎症细胞因子的表达(结果重复中)。五、体内特异性阻断TREM-1与配体结合对CVB3诱导VMC的影响为直接证实TREM1在CVB3诱导的VMC发病中的作用,在CVB3感染的第-1、3天以TREM-1特异阻断剂(100μg/鼠)LP17注射小鼠,评估VMC的发病情况。结果发现:相对CVB3感染小鼠,LP17处理小鼠的死亡率和体重减轻率都显著改善(p<0.05)。心脏炎性细胞浸润显著减少(p<0.05);第7天心脏匀浆液各炎症细胞因子水平均显著降低(p<0.01)。提示TREM1在CVB3诱导的VMC中具有放大炎症的作用。六、小鼠中性粒细胞经TREM1-HMGB1通路促进CVB3诱导的心肌炎为阐明中性粒细胞表面的TREM1识别HMGB1后在CVB3心肌炎的功能,以HMGB1蛋白预刺激中性粒细胞回输、或同时予以腹腔注射LP17特异抑制TREM1功能,检测CVB3感染7天病毒复制、心脏炎症浸润的变化。结果发现:1)小鼠生存率未见显著改变,但是以LP17体内阻断TREM1功能后,HMGB1蛋白预刺激中性粒细胞回输导致的小鼠体重剧烈减轻得以显著回升。即阻断TREM1可显著抑制中性粒细胞的促病毒复制功能。2)心肌炎:LP17肽处理后显著减轻了HMGB1预刺激的中性粒细胞回输小鼠导致的心肌炎显著加剧。提示LP17阻断TREM1产生了一定治疗效果。3)病毒复制:LP17肽处理小鼠显著降低了HMGB1预刺激中性粒细胞回输小鼠导致的心脏病毒复制显著加剧,且几乎回复至WT中性粒回输小鼠的水平。提示LP17对于TREM1的阻断产生了抑制病毒复制的治疗效果。4)脾脏淋巴细胞亚群:LP17肽阻断TREM-1,发现脾脏淋巴细胞浸润急剧下降的情况均显著得以改善,所有细胞均显著回升(P<0.05),特别是中性粒细胞、单核细胞、CD4+T和CD8+T细胞数目均几乎回复到单纯CVB3感染的水平;但巨噬细胞仅发生部分回复,仍显著减少(p>0.05,vs HMGB1-中性粒组)。综上,本研究首次研究了中性粒细胞在CVB3感染小鼠诱导的急性病毒性心肌炎中的作用和分子机制。我们发现:中性粒细胞在CVB3感染最早期(0-2天)早于巨噬细胞浸润于心脏,其识别病毒PAMPs后激活抗菌肽等分泌试图清除病毒,然而其心脏浸润、分泌炎症细胞因子和对其他免疫细胞的调节最终促进了心脏炎症浸润的加剧;与此同时,中性粒细胞通过表面显著上调的TREM1受体识别CVB3裂解心肌细胞释放的高水平HMGB1,这一HMGB1/TREM-1信号通路的激活最终非常显著地促进了病毒在心脏和脾脏的复制、进而显著降低外周各淋巴细胞亚群(特别是中性粒细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞)数目,同时,显著促进了中性粒细胞等向心脏组织的浸润,促进急性VMC的进程。本研究的意义不仅在病毒性心肌炎疾病模型中重新认识了中性粒细胞对于病毒感染的重要防御和免疫调节功能,更为急性病毒性心肌炎的治疗干预提供了基于中性粒细胞和HMGB1、TREM1的新分子靶点。