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抗菌肽因其独特的优点，成为新型抗菌药物研发关注的对象和热点。目前已从鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目、等翅目、膜翅目、蜻蜒目、毛翅目、同翅目等多个目的多种昆虫鉴定出200多种昆虫抗菌肽。由于昆虫种类巨大，还有很多新的昆虫抗菌肽未被鉴定发现。桔小实蝇BactroceradorsalisHendel是果蔬的重要害虫，在广东省目前也是导致柑橘、枇杷等果树挂果时为害特别严重的害虫之一。作为双翅目昆虫的桔小实蝇，在它的基因组内，理论上应该有抗菌肽基因，但目前文献未见相关报道。
本研究在课题组已成功地建立起桔小实蝇实验室室内种群的基础上，利用混合细菌针刺的方法，免疫诱导桔小实蝇成虫、幼虫及蛹分泌抗菌活性物质，采用生物活性检测和多种分离纯化技术的策略，成功地从桔小实蝇蛹中分离得到一个新的具有抗革兰氏阳性菌的小分子短肽。主要研究结果如下：
1.经过对比实验和条件优化，得出抗菌物质的提取条件为：50mmol/L醋酸铵(pH5.0)，含有蛋白酶抑制剂Aprotinin(终浓度1.5μmol/L)和苯基硫脲(终浓度20μmol/L)；提取粗提物时，按1克虫重加5毫升缓冲液的比例加入提取缓冲液冰浴上研磨。离心，上清即为提取的粗提物。
2.生物活性测定实验表明，未经诱导的桔小实蝇成虫、幼虫和蛹的粗提物均有抑菌活性，而用混合菌诱导后，其抑菌活性大大增强，暗示桔小实蝇的抗菌肽基因有基础性的表达，诱导可加强抗菌肽基因的表达。
3.经过比对实验，确定诱导24小时的5日龄蛹为最佳提取材料。粗提物对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)和大肠杆菌K12D31(革兰氏阴性菌)均有抑制作用。热处理后对革兰氏阳性菌的抑菌作用得到保留，对革兰氏阴性菌没有抑菌活性。
4.通过低温高速离心、加热处理、0.45μm滤膜过滤和MWCO10,000超滤离心管超滤，有效地去除了粗提物中对热不稳定的蛋白，同时达到了对样品进行有效的浓缩，利于进一步的分离纯化和抗菌活性检测。
5.以pH值为5的醋酸铵缓冲液系统进行阳离子交换色谱(CMSepharoseFastFlow柱)的第一步分离纯化，得到了3个对金黄色葡萄球菌有抑菌活性的有效成分，通过Tricine-SDS-PAGE电泳检测，表明纯化后的产物已经去除了与抗菌活性无关的物质，达到了预期的初步分离纯化和富集的目的。
6.阳离子交换色谱样品通过Hiprep16/60SephacrylS-100HighResolution层析柱凝胶过滤色谱，得到6个对金黄色葡萄球菌有抑菌活性的组分。电泳检测表明凝胶过滤层析有效地将无抗菌活性的大分子量蛋白同有抗菌活性的小分子量蛋白分离。
7.同时对阳离子交换色谱样品选用RESOURCETMRPC3mL层析柱进行RP-FPLC，得到4个对金黄色葡萄球菌有抑菌活性的组分，其分离得到组分的抑菌效果高于Hiprep16/60SephacrylS-100HighResolution层析柱分离后的组分，对其抑菌活性最高的RPC-2组分再次进行RP-HPLC(HypersilODS层析柱)分离，最终得到了纯度较高的抗金黄色葡萄球菌的活性成分。
8.通过TOF-MS对纯化的抗菌物质进行分子量测定，表明该桔小实蝇抗菌肽分子的分子量为2.3kDa。用Edman降解法蛋白测序仪对纯化的桔小实蝇抗菌肽分离组分进行氨基酸序列测定，结果显示该肽包括20个氨基酸残基(H2N-VGKTWIKVIRGIGKSKIKWQ-COOH)，富甘氨酸。同源性搜索显示该抗菌物质与鞘翅目昆虫的ColeoptericinA、ColeoptericinB、ColeoptericinC以及Rhinocerosin的C-末端的20个氨基酸的相似性均为70％左右，将该抗菌活性物质命名为Bactrocerin。
9.对桔小实蝇抗菌肽Bactrocerin与鞘翅目富含甘氨酸的抗菌肽、双翅目昆虫富甘氨酸的抗菌肽Diptericin和半翅目富甘氨酸的抗菌肽Hemiptericin进行系统发育分析，结果显示：Bactrocerin与鞘翅目富含甘氨酸的抗菌肽ColeoptericinA、B和C、Rhinocerocin、Coleoptericin、Acaloleptins以及Hlotricin2有较强的亲缘进化关系，暗示它们可能来源于同一个祖先基因，并形成一个基因家族。而与同目富含甘氨酸的抗菌肽Diptericin亲缘关系较远。
10.据上分析鉴定结果，由桔小实蝇蛹中分离的Bactrocerin是一个具有抗革兰氏阳性菌活性的新的昆虫抗菌肽分子，是目前已鉴定发现的富甘氨酸的昆虫抗菌肽中最小的一种。
本研究成功地由桔小实蝇蛹中分离鉴定到新的抗菌肽Bactrocerin序列，为进一步克隆桔小实蝇抗菌肽Bactrocerin基因，进行更深入的相关研究奠定了基础，将对揭示桔小实蝇与其它昆虫之间在免疫应答机制上的异同研究提供新的参考，也为将来的生物技术研发利用提供了条件。