背景肿瘤转移一个多步骤的复杂病理过程,是肿瘤治疗失败的主要原因。通常来讲,肿瘤转移主要包含以下几个关键步骤:局部肿瘤细胞浸润、肿瘤细胞内渗进入血液循环、肿瘤细胞随血液循环到达远位、肿瘤细胞外渗进入周围组织和肿瘤细胞克隆化形成转移灶。其中,最后一个步骤,肿瘤细胞的克隆化是整个肿瘤转移级联反应中效率最低的步骤。MiRNAs对多步骤的肿瘤转移具有重要调控作用,其中miR-200c既可以通过EMT抑制肿瘤转移,又可以通过促进肿瘤细胞的克隆性增殖促进肿瘤转移。肿瘤细胞的分泌蛋白质组可以有效地重塑肿瘤微环境并改变肿瘤细胞本身的细胞生物学特性,对肿瘤转移具有重要意义。SEC23A是外壳蛋白复合物COPII的重要组成成分,负责蛋白质从内质网到高尔基体的运输以及细胞蛋白质分泌,已有许多研究阐明了Sec23a通过影响分泌蛋白质组进而对肿瘤转移产生抑制作用。钙结合蛋白S100A8是一种多功能的分泌蛋白,它通过与S100A9形成二聚体的形式调控细胞生物学功能,但其与肿瘤转移的关系尚未见有研究。自噬是一种进化保守的能量代谢过程,在营养缺乏等其他环境压力条件下,自噬通过降解胞内蛋白质和细胞器,为细胞提供生物化学反应的底物,维持细胞的稳态。自噬与肿瘤转移的关系与肿瘤转移的不同阶段密切相关,在肿瘤转移的不同阶段,自噬可以通过不同的分子机制对肿瘤转移发挥不同的调控作用。目的1、探索miR-200c对肿瘤转移的双重调控作用。2、检测Sec23a对肿瘤细胞分泌蛋白质组的影响。3、研究Sec23a通过分泌蛋白质组调控肿瘤转移的分子机制。4、研究Sec23a通过分泌蛋白质组调控细胞自噬的分子机制。5、探索自噬在肿瘤细胞克隆化过程中对肿瘤转移的影响。方法1、通过连续的小鼠体内成瘤筛选,建立了来源于人黑色素瘤M14细胞的稳定的寡灶型转移和多灶型转移同源细胞模型。2、通过慢病毒感染的方法稳定敲低或过表达目的基因。3、通过细胞迁移侵袭实验和克隆斑形成实验检测肿瘤细胞的体外转移能力;通过小鼠尾静脉肿瘤移植实验检测肿瘤细胞的体内转移能力。4、通过二维液相色谱-串联质谱(2D-LC-MS/MS)的方法检测分泌蛋白质谱的变化。5、通过拮抗抗体和重组蛋白处理,研究分泌蛋白质对细胞生物学功能的影响。6、通过WB检测、自噬流实验和透射电镜观察细胞自噬的变化。7、通过TCGA数据库分析和临床肿瘤样本免疫组化分析,确定研究结论的临床相关性。结果1、建立了来源于人黑色素瘤M14细胞的稳定的寡灶型转移细胞模型OL和同源的多灶型转移细胞模型POL,与OL细胞相比,POL细胞在体外具有更强的细胞迁移侵袭和克隆斑形成能力,在体内具有更强的肿瘤转移形成能力。2、在肿瘤转移早期,MiR-200c可以抑制肿瘤细胞EMT过程,抑制肿瘤细胞体外迁移侵袭能力;在肿瘤转移晚期,MiR-200c可以促进肿瘤细胞重庆医科大学博士研究生学位论文体外克隆性增殖能力,促进肿瘤细胞体内肿瘤转移形成能力。MiR-200c显著抑制Sec23a基因的表达。3、Sec23a可以显著改变肿瘤细胞的分泌蛋白质谱,促进S100A8的分泌,抑制肿瘤细胞的迁移侵袭和克隆性增殖能力,抑制肿瘤细胞体内肿瘤转移形成能力。4、S100A8可以通过促进BECLIN1的表达启动细胞自噬,抑制肿瘤细胞的迁移侵袭和克隆性增殖能力,抑制肿瘤细胞体内肿瘤转移形成能力。5、自噬在肿瘤转移后期,肿瘤细胞克隆化过程中,抑制肿瘤细胞的克隆性增殖和肿瘤转移。6、Sec23a和Atg5表达水平越高,黑色素瘤病人和结肠癌病人TNM分期期别越低、生存周期越长。结论1、本研究验证了MiR-200c在肿瘤转移前期,肿瘤细胞局部浸润时,通过抑制肿瘤细胞EMT过程,抑制肿瘤转移;在肿瘤转移后期,肿瘤细胞克隆化时,通过抑制Sec23a表达改变肿瘤细胞分泌蛋白质谱,促进肿瘤转移。2、本研究首次发现并验证了“miR-200c-Sec23a-S100A8-自噬-肿瘤转移”的完整的分子调控机制。MiR-200c抑制Sec23a基因的表达、改变肿瘤细胞分泌蛋白质谱、减少S100A8蛋白的分泌、抑制BECLIN1的表达和细胞自噬,最终促进肿瘤细胞的克隆性增殖、促进肿瘤转移的形成。这一分子机制为研究肿瘤转移的机制,尤其是研究肿瘤寡灶型转移向多灶型转移演进的机制提供了新的思路和启示。3、本研究利用TCGA数据库分析和临床肿瘤患者的肿瘤组织检测,确定了Sec23a和Atg5与黑色素瘤病人和结肠癌病人TNM分期、生存周期之间的相关性,Sec23a和Atg5表达水平越高,黑色素瘤病人和结肠癌病重庆医科大学博士研究生学位论文人TNM分期期别越低、生存周期越长,提示我们Sec23a和Atg5可以作为黑色素瘤病人和结肠癌病人临床诊断和预后评价的有利指标。这一肿瘤转移的调控机制是否具有普遍性,有待后期研究进一步阐明。