论文部分内容阅读
研究背景针刺是祖国医学几千年发展中重要的一部分,针灸治疗疼痛类疾病有着独有的优势。一项调查表明：针灸优势病种有腰痛病、头痛病、项痹病、肩凝症、痛经、胃脘痛等等。在疼痛治疗上,针灸疗效明显。临床上发现疼痛常伴随焦虑、抑郁等情绪表现,两者相互影响,往往易加重病情。针刺对改善抑郁、焦虑等疾病也有较好效果。但针刺对缓解疼痛伴随的厌恶情绪是否有效,还不清楚。近年来,采用功能性磁共振成像等技术,发现在大脑中枢系统存在一些参与疼痛不同层面(包括辨识、情绪和情感)加工处理的脑内结构,包括大脑皮层初级及次级躯体感觉区、岛叶、前扣带回、前额叶皮质及丘脑结构；以及杏仁核、基底神经节、小脑、海马、顶叶和颞叶内的一些相关的皮质区等,这些区域结构被称为“疼痛神经网络pain neuromatrix(或神经矩阵)”。这些脑区共同参与疼痛信息在脑内的加工活动。杏仁核是该网络中调节情绪和应激的重要中枢核团。研究表明：其参与疼痛的情绪加工,促进慢性疼痛的产生和维持。其内部结构中有多种生物活性分子参与疼痛的调节。其中,促皮质释放因子(CRF)是中枢系统内重要的应激激素,调节人体内脏活动和情绪反应。谷氨酸(Glu)是主要的兴奋性神经递质,与NMDA等受体结合产生生物活性,参与疼痛的产生和发展。Y氨基丁酸(GABA)是一种抑制性神经递质,其受体是临床多种镇痛药物的治疗靶点,这些物质共同参与了大脑中枢疼痛信息的调控。有学者研究针刺对人体大脑的影响,通过fMRI技术发现在疼痛状态下,大脑多个脑区处于激活状态,而针刺过程中,呈现负激活状态。如海马、杏仁核等边缘系统区域。我们前期的研究表明海马和下丘脑胆碱能系统参与针刺的镇痛过程,而杏仁核与海马同属于大脑边缘系统,参与人体情绪、记忆等生理活动。因此,本实验在慢性痛负性情绪模型大鼠尚,观察电针治疗后,杏仁核内情绪相关的CRF受体、兴奋性氨基酸Glu受体N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)、抑制性氨基酸GABA受体发生的变化,来探讨针刺缓解慢性神经痛大鼠杏仁核内痛感觉和情绪成分变化的机制,为临床针刺治疗疼痛疾病提供理论依据。材料与方法第一部分实验：36只Wistar大鼠分2批进行,分别随机分各3组：正常对照组(NOM)、CCI模型组(CCI)、电针组(EA+CC)、负性情绪模型组(NA)、电针加负性情绪组(EA+NA)。行坐骨神经结扎术造成慢性神经痛模型,手持接通电针仪的针灸针反复刺激CCI大鼠足底造成动物厌恶反应模型。电针双侧“足三里”-“阳陵泉”穴,每日1次,共7天。痛觉测定仪检测大鼠足底热痛阈,计算双足缩腿反应潜伏期差值(PWLD);用荧光定量RT-PCR技术检测杏仁核组织促肾上腺皮质激素释放因子受体亚型CRF-1R、CRF-2R,谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚型NR2A、NR2B及Y-氨基丁酸受体亚型GABAa、GABAc基因的相对表达量。第二部分实验：本次实验使用32只Wistar大鼠,随机分为4组：正常对照组,CCI+NA(负性情绪negative affection)模型组,CCI+NA+电针(EA)组CCI+NA+麻醉电针(AEA)组,每组8只。行坐骨神经结扎术后,对动物连续进行3天足底电刺激造成条件性位置偏恶(conditioned place aversion, CPA,负性情绪)模型。电针和麻醉状态下电针双侧“足三里”-“阳陵泉”穴(1mA,2/15Hz),每日1次,共7天。痛觉测定仪检测大鼠足底热痛阈,计算双足缩腿反应潜伏期差值(PWLD);条件位置厌恶设备记录大鼠在条件控制箱停留时间(CPAs);用蛋白质印迹法(WB)检测杏仁核组织内CRF1R, CRF2R,NMDA-NR2B, mGluR7,以及GABAA-α2, GABABR2受体蛋白表达量。数据统计与分析所有数据为计量资料,以均数±标准差(M±SD)表示,用SPSS16.0统计软件进行数据处理,实验数据采用单因素方差分析,组间两两比较选用LSD检验,P<0.05表示差异有统计学意义。结果1)电针(EA)对慢性痛负性情绪大鼠杏仁核内痛感觉和情绪相关CRF受体等基因表达的影响与正常组相比,CCI、负性情绪组PWLD均显著增加(P<0.05),分别与两模型组比，电针7天后,电针组与电针加负性情绪组PWLD显著下降(P<0.05).显示出明显镇痛效应。PCR的结果表明：与正常组比较,CCI模型组CRF-1R、CRF-2R、NR2A、NR2B受体基因表达量均显著增加(P<0.05),GABAaR及GABAcR基因表达变化不明显(P>0.05),而负性情绪组6个指标基因表达量均显著降低(P<0.05)。分别与两模型组比,电针组CRF-2R、NR2A、NR2B基因表达量显著降低(P<0.05),负性情绪动物电针组除CRF-1R表达相对升高(P>0.05),其他基因表达量均显著增加(P<0.05)。2)电针(EA)对慢性痛负性情绪大鼠杏仁核内痛感觉和情绪相关CRF受体等蛋白表达的影响与正常组相比,条件位置厌恶(CPA)模型建立后,负性情绪模型组和两电针组PWLD值均显著增加(P<0.001)；与模型组相比,电针组和麻醉电针组PWLD差值在电针5天和7天后均显著下降(P<0.001)。条件位置厌恶实验结果表明：CPA模型建立后,与正常组比较,负性情绪组和两电针组在条件控制箱停留时间明显缩短P<0.001)；与模型组相比,电针和麻醉电针组在电针7天后在条件控制箱内停留时间延长,而电针组停留时间显著增加P<0.001),这表明电针和麻醉电针可以起到显著的镇痛作用,其中电针可以抑制疼痛厌恶情绪,麻醉电针无显著效应。Western blot实验结果表明：与正常组相比,模型组、两电针组大鼠杏仁核内CRF-1R、CRF-2R、NR2B、mGluR7、GABAA及GABAB蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)。小结1、重复电针足三里、阳陵泉可明显减少神经性疼痛和负性情绪在CCI和CCI负性情绪动物2、电针可对慢性痛和负性情绪大鼠产生的镇痛效应可能与其下调杏仁核内CRF-1R、CRF-2R、NR2A、NR2B受体mRNA,上调负性情绪大鼠CRF-2R、NR2A、NR2B、 GABAa和GABAc受体mRNA的表达有关。3、电针足三里-阳陵泉对疼痛诱导的厌恶情绪大鼠杏仁核内CRF-1R、CRF-2R, NR2B, mGluR7, GABAA和GABAB受体蛋白表达无显著效应,其结果有待进一步