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前言与目的肾母细胞瘤为儿童期较常见的恶性实体肿瘤,占小儿所有实体肿瘤的8%,在15岁以下儿童中,占泌尿生殖系恶性肿瘤的80%以上,据不完全统计,包括世界各国的任何种族,全世界每百万人口中,肾母细胞瘤的发生数约为7例,其在小儿外科疾病中占重要的地位。虽然肾母细胞瘤经手术及化疗等综合治疗,其预后得到了极大的改善,但肿瘤的复发和转移仍是最终造成患儿预后不良的重要原因,了解肾母细胞瘤生长过程中生物学特征及调控机制,对于研究针对性的治疗方法与药物有着重要的指导意义。肿瘤中新生血管的形成是肿瘤生长的必需条件,血管生成在原发肿瘤的生长与侵入中至关重要,目前血管生成与实体肿瘤发展、转移等的关系为当前肿瘤学研究热点。实体肿瘤的发展必需有血管生成的参与。血管生成是实体肿瘤生长和转移的必要条件,目前已公认,血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)是目前所知主要的血管内皮生长因子,VEGF在促进肿瘤血管内皮细胞增殖和增加血管通透性方面起着重要的作用,本研究以VEGF为中心,研究肾母细胞瘤组织中VEGF及与其密切相关的细胞因子的表达情况及临床意义,相对系统的研究肾母细胞瘤血管生成的调控机制。通过对肾母细胞瘤与血管内皮生长因子及血管生成素关系的研究可能为临床对肾母细胞瘤的治疗提供一条新的途径,成为治疗Wiims.瘤的新的突破点。材料和方法临床标本:取自卫生部小儿先天畸形实验室标本库,肾母细胞瘤标本52例,其中男27例,女25例,年龄在0.5~11岁,平均年龄4.2岁,均经病理证实;按NWTS-5标准根据间变细胞情况组织学分型:良好组织学类型35例,不良组织学类型17例。其中47例标本手术后立即在癌组织边缘以外的竖组织处取材,另有8例非肾脏疾病死亡尸检肾组织作为对照。标本均在手术中无菌取材后液氮处理,拟行RT-PCR的标本放入经DEPC水(diethyl pyrocarbonate,二乙基焦磷酰胺)处理并高压灭菌后的Eppendoff管中,入-80℃深低温冰箱保存。随访情况:所有病例随访2年以上者31例,7例因肿瘤复发转移而死亡。免疫组化试剂:抗Ang1,Ang2及Tie2、Survivin、Stat3抗体为兔抗人多克隆抗体即用型(购自福建迈新生物技术公司),抗CD34、VEGF及Flt、HIF-1α抗体为兔抗人多克隆抗体即用型(武汉博士德生物技术公司)。RT-PCR试剂盒、Marker(DNA Marker DL2000)、Taq2酶、dNTP Mixture、琼脂糖均由TAKARA Biotechnolgy(大连)Co.提供:RNA裂解液购于TRIZOL Reagent(Total RNA isolation,美国)。应用RT-PCR和免疫组化SABC方法检测WT标本中不同部位的血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(FLT)和血管生成素(Ang1、Ang2)及其受体(Tie2)的表达,以免疫组织化学检测内皮细胞特异性的标志分子CD34,并且分析血管密度与促血管生成因子表达的关系。采用免疫组化SABC法及RT-PCR方法研究Survivin及VEGF在52例肾母细胞瘤组织,47例瘤旁组织及8例肾组织在蛋白水平及mRNA水平的表达情况。结合临床及随访资料分析。应用免疫组化SABC法辅以计算机图像分析的方法,应用Image-plus pro 5.1图像分析软件半定量研究Stat3、HIF-1α与VEGF的在52例WT组织,47例瘤旁组织及8例肾组织表达强度情况,结合临床资料加以分析。结果1、与正常肾组织比较,WT组织及瘤旁肾组织中VEGF表达明显增高(P＜0.05),Ang2在WT组织及瘤旁肾组织及正常肾组织比较,差异显著(P＜0.05),Ang1、Fk受体在各组织间表达虽未见明显差异(P＞0.2),但Ang1在WT组织及瘤旁肾组织中的表达存在增高的趋势。在肿瘤组织中,围绕着癌巢的新生血管数量明显增加,血管排列紊乱、密集、扭曲;而在瘤旁组织中,血管的形态呈向外扩展浸润性生长,密度高于其周围肾组织,与血管因子及其受体的表达高低是明显一致的。2、肾母细胞瘤组织中Survivin免疫组化显示阳性表达率为61.5%(32/52),RT-PCR阳性率为67.3%(35/52);47例瘤旁组织中免疫组化显示阳性表达率为4.3%(2/47),RT-PCR阳性率为6.4%(3/47);肾组织中未见表达。52例肾母细胞瘤组织中VEGF免疫组化显示阳性表达率为75%(39/52),RT-PCR阳性率为71.2%(37/52);47例瘤旁组织中免疫组化显示阳性表达率为57.4%(28/47),RT-PCR阳性率为53.2%(25/47);肾组织中免疫组化显示阳性表达率为12.5%(1/8),RT-PCR阳性率为25%(2/8)。另外,Survivin及VEGF在预后不良型肾母细胞瘤组织及瘤旁组织中表达均明显增高。Survivin及VEGF阳性者2年存活率均低于其表达阴性者。3、VEGF、Stat3及HIF-1α在肾母细胞瘤组织中表达强度较瘤旁组织及正常肾组织显著增强(P＜0.05)且瘤旁组织中VEGF表达强度高于正常肾组织。另外,临床分期Ⅲ～Ⅳ和预后不良病理类型的肾母细胞瘤组织中Star3及VEGF表达强度明显高于临床分期Ⅰ～Ⅱ的WT,预后不良病理类型及直径≥6cm的肾母细胞瘤组织中HIF-1α表达强度较预后良好型及直径＜6cm的肾母细胞瘤组织升高。结论1、在肾母细胞瘤的生长过程中,VEGF/FLT和Angiopietins/Tie2两条通路均有不同程度的活化,但不协调,使得肾母细胞瘤组织中的血管处于不成熟状态,这为进一步开发抑制血管生成的抗肿瘤生长药物提供了科学依据。2、Survivin,VEGF表达与肾母细胞瘤的临床病理学特点有关,Survivin在血管形成的中间环节具有重要意义,Survivin和VEGF在肾母细胞瘤中表达具有一致性,二者在肾母细胞瘤组织的高表达与肿瘤的生物学行为密切相关,其与肿瘤血管的生成,血管内皮细胞的凋亡,稳定性密切相关,进而影响肿瘤的侵袭力。其检测有利于肾母细胞瘤的诊断及其预后情况的评价。3、VEGF、Stat3及HIF-1α表达与肾母细胞瘤的发展预后有关,参与了肿瘤血管的生成及肿瘤的增殖侵袭,Stat3可能对HIF-1和VEGF的表达起着重要的调控作用,对于靶向治疗肾母细胞瘤具有一定意义。