一、研究背景在全球范围内,心血管疾病是危害人类健康的主要疾病。在致残致死的心血管疾病中,75%以上是由动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)引起,故As是心脑血管疾病发生的重要病理基础。目前普遍认为As是一种慢性、进展性、炎症性疾病,而明确As的发病机制是防治心脑血管病的根本措施。动脉粥样硬化斑块的形成是一个复杂而漫长的过程,目前认为该病理过程由多种因子参与,而炎症反应贯穿动脉硬化发生发展的全过程。在大量的细胞因子作用下,内皮细胞发生损伤,内皮细胞通透性下降,单核细胞穿透内皮层进入内皮下形成巨噬细胞,巨噬细胞在血管内膜吞噬脂滴形成泡沫细胞,平滑肌细胞大量增殖并合成大量的细胞外基质,形成了一个由脂纹、纤维斑块、粥样斑块到斑块破裂的复合病变过程。临床病例观察发现,动脉狭窄的程度与急性心脑血管事件如急性冠状动脉综合征、急性缺血性脑卒中等发生并不成平行关。越来越多的研究表明,急性心脑血管事件的发生不仅取决于动脉管腔的狭窄程度,更重要的决定因素是动脉粥样硬化不稳定斑块的形成。不稳定斑块即出现破裂的斑块,又称易损斑块,其病理特征主要为胶原含量减少,平滑肌细胞减少,炎症细胞广泛浸润,较薄的偏心性纤维帽,较大脂质核心,斑块表面裂隙,斑块内出现新生血管,斑块内出血、钙化等。不稳定斑块引起的斑块破裂、血栓形成和血管腔阻塞是引起急性心脑血管事件的主因。明确不稳定斑块的发生机制对于预防急性心脑血管事件的发生具有十分重要的理论和临床意义。目前,不稳定斑块形成的病理生理学机制主要包括斑块内炎症反应的增加、新生血管形成和细胞大量凋亡,而诱导这些过程改变的分子机制并不完全清楚。基因表达芯片技术可同时比较成千上万个基因的表达变化,全面筛选某一表型或某一疾病的所有相关基因,还可揭示不同基因表达变化之间的相互关系,从而为研究基因与基因之间的内在联系提供线索。基因表达谱分析技术应用到动脉粥样硬化领域已有14年的历史。在这期间,国内外研究学者基于芯片研究识别了许多动脉粥样硬化发生发展过程中相关的重要基因和通路,对深入理解和全面认识该疾病做出了巨大的贡献。基因表达谱分析可以为动脉粥样硬化机制研究提供一种全新的研究模式,为基础研究提供潜在的思路和方向。目前虽然有较多的动脉粥样硬化基因表达谱分析研究,但大多数研究在实验设计和数据分析方面存在一定的问题。首先,样本选取不规范如不同来源和不同部位血管组织间分析比较会引入较多的混杂因素,影响分析结果的可信度；第二,样本量过少,可能会影响到结果的可靠性和稳定性。第三,动物模型与人的物种间差异可能会影响一些研究成果在临床中的推广应用,如适合动物的治疗靶点未必在人体试验中有效。第四,芯片数据分析过于简单,没有使用系统生物信息学分析,可能会遗漏芯片中的重要生物信息。所以,较大样本规模的、相同来源的人体血管组织、同时经过系统的生物信息学分析的研究仍然是十分缺乏和急需的。在本次研究中,通过ArrayExpress数据库获取不稳定颈动脉粥样硬化斑块和稳定颈动脉粥样硬化斑块间差异表达基因谱,并运用生物信息学方法分别在GO语义、KEGG通路和蛋白互作网络中初步探索不稳定斑块形成的分子机制,并在mRNA和蛋白水平验证本次研究所获取的疾病相关风险基因的差异程度,旨在寻找引起不稳定斑块发生的主要相关疾病基因和通路。这些为我们未来深入研究不稳定斑块发生机制、筛选心脑血管事件早期预警指标和寻找稳定斑块的生化指标和治疗靶点提供理论指导。本研究共分为两部分：1、差异基因表达谱获取疾病相关基因及通路；2、在mRNA和蛋白水平上对疾病相关基因进行实验验证。二、研究目的1、获取不稳定斑块差异基因表达谱、疾病相关基因和通路2、在人体颈动脉不稳定斑块组织和稳定斑块组织中验证TYROBP、 CXCR4和VCL差异程度。三、研究方法1、下载基因表达谱原始数据从ArrayExpress数据库中下载E-MTAB-2055数据集的原始文件后,分别对探针水平的信号值进行质控、变异稳定性分析、背景矫正、数据归一化和基因注释,最终转化为基因水平的表达值。2、获取差异表达基因应用T检验和差异倍数法(fold-change, FC)识别不稳定斑块和稳定斑块间差异表达基因谱。3、差异表达基因功能富集分析通过DAVID网站(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)提交基因表达谱获取的差异表达基因,分别进行GO术语和KEGG通路富集分析。4、构建蛋白互作网络从string(版本号9.1)网站下载人类所有的蛋白互作关系列表,获取差异表达基因在蛋白层面的互作网络,将差异表达基因构成的蛋白互作网络导入到Cytoscape(版本号2.8.2)进行网络分析,查找疾病相关风险模块(module)及风险基因。5、获取颈动脉不稳定斑块组织和稳定斑块组织从南方医院血管外科手术室收集颈动脉斑块组织,彩色多普勒超声分辨颈动脉斑块性质,选取有不稳定斑块特征并进行颈动脉环切术的患者纳入本次研究,将手术切除连带的斑块旁组织作为对照斑块(稳定斑块)使用。6、检测人颈动脉血管组织(稳定斑块和不稳定斑块组织)中TYROBP、 CXCR4和VCL在转录水平的表达情况。7、检测人颈动脉血管组织(稳定斑块和不稳定斑块组织)中TYROBP、 CXCR4和VCL在蛋白水平的表达情况。四、统计学处理1、获取差异表达基因使用T检验和FC方法。差异表达基因筛选阈值为p-value<=0.01且|logFC|>1。富集分析使用的统计学方法为超几何检验,GO富集筛选阈值为FDR<=0.01, KEGG富集筛选阈值为p-value<=0.05=2、所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差(x±s)表示,所有统计分析由SPSS 19.0统计软件包进行处理,不稳定斑块与稳定斑块组织之间各个基因差异表达情况的比较采用Mann-whitney U检验统计分析。检验水准：α=0.05,P<0.05有统计学意义。五、研究结果1、差异表达基因筛选结果本研究共获取439个差异表达基因,其中上调基因232个,下调基因207个。差异表达上调基因倍比变化最大的基因是heme oxygenase 1 (HMOX1, logFC=3.1),差异表达下调基因倍比变化最大的基因是alpha-actin (ACTC1, logFC=-2.2).2、差异表达基因功能富集分析结果GO富集结果显示免疫应答、免疫防御、炎症应答、细胞粘附、细胞因子等富集显著性最高。通路富集结果显示溶酶体通路、细胞因子信号通路、PPAR信号通路、细胞因子-细胞因子互作通路、白细胞跨膜迁移通路、补体凝血级联反应通路、造血细胞谱系和酪氨酸代谢通路等被显著富集。3、差异表达基因构建蛋白互作网络(protein protein interaction network,PPI)分析结果在PPI网络中,TYROBP、CTSS、C1QB、PLEK、IGSF6、HCK、VCL、 LAPTM5、CXCR4和FCER1G在蛋白互作网中处于网络中心位置,在生物网络中发挥着重要作用,可能与本次研究的老年人颈动脉不稳定斑块发生存在关联。按风险模块中基因数目不少于5个的阈值标准,本次研究共获取了四个与不稳定斑块相关的风险子模块,TYROBP、CXCR4、VCL和APOE分别占据四个模块中心位置,在风险子模块中发挥关键结点作用。4、与稳定斑块组织相比,不稳定斑块组织中TYROBP、CXCR4在mRNA水平表达上调,采用Mann-whitney U检验显示P<0.05,差异有统计学意义；VCL在不稳定斑块组织中表达下调,但无统计学意义。5、与稳定斑块组织相比,不稳定斑块组织中TYROBP、CXCR4在蛋白水平表达明显增加；VCL在不稳定斑块组织中表达降低。六、结论1、免疫和炎症反应在不稳定斑块发生中发挥重要作用；2、差异基因表达谱分析显示TYROBP和CXCR4表达下调,VCL表达上调,其可能在不稳定斑块形成过程中发挥作用；3、在mRNA水平,CXCR4和TYROBP在不稳定斑块组织中表达上调,差异在两组间有统计学意义；VCL在不稳定斑块中呈现下调趋势,但无统计学意义；在蛋白水平层面,CXCR4、TYROBP在不稳定斑块组织中表达明显增多,VCL在不稳定斑块组织中表达明显减少；差异表达基因实验验证结果基本与芯片分析相一致。5、TYROBP、CXCR4和VCL有可能成为不稳定斑块进展及预后的新的分子标志物,可能为逆转不稳定斑块提供新的治疗靶点。