自噬失调已被证实与包括癌症在内的许多人类疾病有关联。自噬功能作为抑制子可在肿瘤发生的早期清除癌症前期细胞,也可以作为促进子在肿瘤的发展过程中以及营养受限或低氧条件下,增强肿瘤细胞的存活。这是人们对自噬的总体看法。在化疗和放射线治疗癌症的情况下,自噬诱导反应可保护肿瘤细胞。本研究的目的是为了更好地了解自噬调控的分子机理,进而阐释怎样精确地控制自噬的启动或抑制,从而达到治疗和阻止肿瘤的发展。在锚定组蛋白H3K9甲基化转移酶的过程中,从分子水平上为在肿瘤细胞中控制自噬活性提供新理论和新方法。在本研究中,我们调查了H3K9甲基化在控制自噬应答中的功能。我们发现,一些具有催化H3K9单甲基化和双甲基化的H3K9甲基化转移酶G9A的小分子抑制子,能在多种肿瘤细胞系里触发强烈的自噬。这种自噬表型能通过shRNA介导的基因抑制G9A蛋白表达而重现。这项研究从生理学功能和分子机制方面理清了H3K9甲基化和自噬调控之间的联系,从分子水平上阐明了G9A的抑制子调控自噬的机制,这对鉴定一组快速而且可控制自噬活性的小分子抑制子具有重要意义,对治疗疾病促进健康等方面也有重要影响。丝氨酸-甘氨酸生物合成通路是癌细胞代谢的一个必需的部分,增强此通路的活性,能促使癌细胞增殖所必需的有机大分子的生物合成。这条通路是否受表观遗传控制,目前还属未知。我们的研究证实,组蛋白赖氨酸甲基转移酶G9A是维持此通路上处于活性状态酶基因和此通路在应答丝氨酸缺乏时转录激活所必需的。通路上酶基因的活性状态是以组蛋白赖氨酸H3K9的单甲基化来标记的。G9A失活则丝氨酸和它的下游代谢产物消耗增加,在不同组织来源的癌细胞系中通过自噬方式引发细胞死亡。通常在各种癌症中都能检测到G9A蛋白水平表达较高,而且与癌症病人的死亡率有较高的相关性,它增加丝氨酸的产出,增强细胞的增殖和肿瘤细胞的转化潜能。这些发现证明,依赖G9A的表观遗传程序调控癌细胞代谢,从而为通过抑制G9A作为治疗癌症的策略提供了理论基础。BIX01294抑制肿瘤细胞存活BIX01294是一个专门抗G9A (IC50=1.7uM)和G9A-like protein (GLP)(IC50=0.7uM)的小分子抑制子,并且对其它已知的组蛋白甲基化转移酶没有明显的影响,剂量可达37uM。G9A和GLP主要以异质二聚体的形式存在于细胞内,在有机体内以催化组蛋白上的赖氨酸9单甲基化和双甲基化著称。在G9A基因敲除老鼠中,只有H3K9mel和H3K9me2的蛋白水平显著下降。经过BIX01294处理后的细胞,其H3K9me1和H3K9me2水平明显降低。作为我们对神经母细胞瘤细胞增殖、分化、和存活的表观遗传控制研究的一部分,我们对人的神经母细胞瘤细胞系,BE(2)-C和SHEP1,用5uM的BIX01294处理,细胞死亡水平显著提高,此结果是通过显微镜下细胞的形态及trypan blue exclusion assays等实验所获取的；BE(2)-C细胞失去在软琼脂上生长的能力。神经母细胞瘤细胞经BIX01294处理后,出现明显的形态变化,大量的小囊和液泡聚集在细胞核周围,这种表现在所有检查的肿瘤细胞系里都能观察到,包括U2OS(osteosarcoma), HeLa(cervical), RKO(colon), HCT116(colon), Hep2G(liver), J82(bladder) HEK293(embryonic kidney),和MCF7(breast)。这样,抑制肿瘤细胞的存活是BIX01294的一个主要性能。BIX01294诱导自噬肿瘤细胞经BIX01294处理后,观察到的小囊和液泡,在形态学上与自噬小体的结构非常相似,即在自噬过程中一个双膜结构隔离了细胞器、蛋白和脂质。因此我们在电镜下检查了细胞的超微结构,通过免疫印迹检查LC3的脂质化,以及免疫荧光法监测了LC3阳性斑,从而论证是否BIX01294诱导了自噬。LC3是酵母菌自噬相关蛋白Atg8的哺乳动物的同源基因,它被Atg4紧接着蛋白水解转化成LC3-Ⅰ。通过自噬诱导,LC3-Ⅰ转化成脂质化的LC3-Ⅱ形态,而后者进一步被嵌合进自噬小体膜内,从而形成LC3-Ⅱ阳性斑结构。LC3-Ⅱ蛋白水平与自噬小体的水平正相关。电镜下显示,经BIX01294处理的细胞,有大量双层膜结构的液泡,里面含有内质网碎片和别的细胞质成分。免疫荧光试验显示LC3-Ⅱ阳性斑的数量显著增加。为了解决自噬小体的增加是由于自噬小体结构的增加还是自噬小体的逆转被阻止了这个问题,我们做了在有或无氯喹的情况下,BIX01294诱导的LC3-Ⅱ免疫印迹分析试验,氯喹能阻止溶酶体的酸化,这样,自噬小体就不降解。氯喹进一步增加BIX01294处理的细胞中的LC3-Ⅱ水平,表明BIX01294提升了LC3-Ⅱ的量,而非阻止LC3-Ⅱ降解。我们还通过wild-type和Atg5-/-老鼠的胚胎成纤维细胞(MEFs)验证了BIX01294诱导自噬的能力。Atg5是自噬小体形态结构的必要成分,Atg5-/-细胞抵抗自噬诱导的产生。BIX01294能在野生型MEF细胞里诱导LC3-Ⅱ阳性斑,但在Atg5-/-, MEFs里不产生。重要的是,我们还获得了用UNC0638处理后,与BIX相似的结果,UNC0638也是一个G9A的特殊抑制剂。总之,所有的发现都说明了G9A的小分子抑制子是强烈的自噬诱导子。在自噬诱导反应中,G9A是BIX01294的活性靶标尽管BIX01294被证明归入G9A的特效抑制子,但在自噬诱导反应里,它还有可能以别的蛋白作为靶标。为说明这个问题,我们沉默了G9A蛋白,看能否再次重演如BIX01294那样诱导的自噬现象。我们检查了5个抗人的G9A基因不同位点的shRNA序列片段的慢病毒载体结构,其中4个(G9A-sh1-4)在G9A表达抑制方面,效果相当的高效,而G9A-sh4的效果最为明显。G9A被抑制,就像经BIX01294处理那样,强烈地在表达mCherry-EGFP-LC3B的细胞里诱导LC3-Ⅱ阳性斑结构。接着,我们用mCherry-EGFP-LC3B表达结构,载体对照,G9A,及G9A和G9A-sh4的表达结构等瞬时转染293细胞。在仅表达1nCherry-EGFP-LC3B的对照组细胞,BIX01294诱导了LC3-Ⅱ阳性斑结构。超量表达G9A大大地消除了BIX01294诱导LC3-Ⅱ阳性斑的能力,而G9A与G9A-sh4共转染,则与之相反。以上这些发现说明G9A在自噬诱导反应里是BIX01294活性的基本靶标。G9A被抑制或沉默后转录地抑制了丝氨酸-甘氨酸的生物合成我们检查了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mammalian target of rapamycin complex1, or mTORC1)的激酶活性。免疫印迹实验显示,BIX显著地抑制了mTORC1激酶的活性,这可通过nTORC1的一个主要底物,核糖体蛋白S6激酶(S6K),它的磷酸化作用显著降低检测到。这个发现说明,G9A被抑制引发自噬是干预了细胞生长和生存信号上游的mTORC1。关于G9A在表观遗传控制的转录中所起的作用,我们做了微阵列分析来识别那些潜在的,在自噬诱导中牵涉的G9A的靶的。共有615个对BIX应答的基因(≥±1.50fold, p<0.01)被鉴别出,其中302个基因被上调,313个被下调(Table S1)。基因本体学分析揭示,在那些被BIX下调的基因中,处于丝氨酸-甘氨酸生物合成通路上的则显著富集,这包括,磷酸甘油酸酯脱氢酶(PHGDH),磷酸丝氨酸氨基转移酶1(PSAT1),磷酸丝氨酸磷酸化酶(PSPH),和丝氨酸羟甲基转移酶2(SHMT2)。我们在四种不同肿瘤细胞系里通过定量反转录PCR (qRT-PCR)实验,证实BIX具有下调这些基因的mRNA水平的能力。时间点实验显示,U20S和HeLa细胞在BIX处理后,分别在2小时和6小时处,这些基因显著下调,当大多数细胞经历自噬前,这种情形至少发生了几小时。我们注意到SHMT1,尽管在HeLa, SHEP1和U20S细胞中被下调,却在BIX处理后的BE(2)-C细胞中被激活。这种明显地细胞依赖型调控的SHMT1表达,其重要性目前在调查中。与微阵列和qRT-PCR数据一致,我们观察到,在BIX处理的细胞中,PHGDH蛋白水平显著降低。相似地,G9A沉默后也导致那些相同基因的mRNA和其蛋白水平明显下调。染色质免疫沉淀和定量PCR (ChIP-qPCR)实验显示,在PHGDH和PSAT1的转录起始位点,BIX显著地降低H3K9mel的水平。相比较,细胞经BIX处理后,H3K9me2的水平,在相同的区域,要么不变,要么显著增加。总体这些数据说明,丝氨酸-甘氨酸生物合成途径是受G9A直接地转录调控制约,即：主要地通过H3K9mel水平的调控；而H3K9mel水平与此通路上的酶基因的活性相关。补加的丝氨酸挽救那些因G9A被抑制后趋于表现死亡的细胞我们通过G9A被抑制或沉默后,来检查受到抑制的这条生物合成途径是引起细胞死亡表型的可能性。气相色谱质谱法(Gas chromatography-mass spectrometry, or GC-MS)分析揭示,U20S细胞在BIX处理后4小时内,仅丝氨酸和甘氨酸水平显著降低,这表明G9A的活性,是维持细胞内丝氨酸和甘氨酸稳定状态的基本要求。我们进一步用液相色谱串联质谱法(Liquid chromatography tandem mass spectrometry, or LC-MS/MS),通过[U-13C]葡萄糖流量分析评定这条生物合成通路的活性；BIX显著降低[U-13C]葡萄糖转换成3-磷酸丝氨酸和丝氨酸的量。重要的是,添入细胞培养液中的丝氨酸在所有被检查的肿瘤细胞系里都显著地减弱BIX或G9A沉默后在细胞增殖和自噬方面对细胞的影响。通过对比,添加进培养液中的甘氨酸对BIX处理的细胞仅有很小的保护作用,而同时加入丝氨酸和甘氨酸没有比只加丝氨酸对细胞更有作用。我们又通过具有细胞渗透性的甲基-丝氨酸-酯基和甲基-甘氨酸-酯基确证了以上这些发现。细胞培养液中单独加入别的氨基酸都不能阻止因BIX诱导的细胞死亡,进一步为丝氨酸作用的特殊性提供了证据。观察到丝氨酸,而不是甘氨酸,能挽救细胞死亡显型这一现象,我们使SHEP1细胞超高表达细胞质酶SHMT1,或主要地线粒体酶SHMT2。仅仅超高表达SHMT1或SHMT2没有显著的影响BIX诱导的细胞死亡。可是,超高表达SHMT2,而不是SHMT1,且协同添加丝氨酸,在BIX存在的情况下,能提高细胞的存活和增殖。这些数据结果一起说明,维持丝氨酸的量和其下游的代谢产物,包括5,10-MTHF,是一条肿瘤细胞代谢的主要机制,通过此通路,G9A维持肿瘤细胞生存和增殖。G9A是丝氨酸缺乏应答的一个关键要素,它耦合丝氨酸量、核糖体生物发生和细胞周期进程加入的BIX完全阻止了由于丝氨酸缺乏引起的PHGDH和PSAT1的诱发,支持了G9A居中介导丝氨酸缺乏应答时的生理学功能。我们通过RNA测序(RNA-seq),对BIX产生应答的基因,利用时间转录组分析(temporal transcriptome profiling)实验对其解析,结果揭示,BIX处理细胞6或24小时基因表达出独特的模式。与此前的微阵列数据一致,BIX处理细胞6小时,下调基因的基因本体学分析(GO analysis)揭示,在丝氨酸生物合成通路上的基因显著富集。但是,BIX处理细胞24小时表现出以显著的基因下调为特征的基因表达模式,而被下调的基因则控制细胞周期进程,这包括细胞周期蛋白A2和B1,及CDC25C。我们通过qRT-PCR确证RNA-seq的结果,qRT-PCR显示,BIX处理后的细胞其丝氨酸合成酶基因和细胞周期基因都相继下调。我们还通过免疫印迹法确证了细胞周期蛋白A2和B1的下调有时间依赖性。重要的是我们发现,细胞被BIX处理24小时与6小时相比,与核糖体生物生成相关的基因显著下调。总体这些数据说明,G9A在耦合丝氨酸感知那些调控蛋白合成和细胞增殖的转录基因方面具有重要功能。G9A促进细胞增殖,具有转化潜能我们发现G9A在SHEP1和U20S细胞中的异常表达,显著地提高了细胞的增殖和那些促进细胞周期进程的基因的表达。这说明,仅是超量表达G9A就已足够赋予肿瘤细胞生长的优越性。此外,G9A超量表达显著地提升SHEP1和U20S细胞不依赖支持物的生长,说明G9A具有转化潜能。总体地,我们的数据结果说明,G9A在肿瘤产生过程中,具有致瘤的潜能。致活丝氨酸.甘氨酸生物合成通路是G9A活性的一个基本作用在SHEP1和U20S细胞里异常表达G9A显著地增高了丝氨酸-甘氨酸生物合成通路上酶基因的mRNA和其蛋白水平,而且ChIP-seq实验揭示,在基因PHGDH和SHMT2的基因座,H3K9me1水平显著增加。我们观察到在相同区域H3K9me2的水平没有明显变化。这些结果说明,G9A通过增加与这条通路上酶基因的基因座相关的H3K9mel水平,激活该通路上的酶基因的表达。如所期望的那样,超量表达G9A显著地提高细胞内丝氨酸和甘氨酸的水平及葡萄糖进入丝氨酸生物合成通路中的流量。我们在超量表达G9A的U20S细胞里,利用shRNA沉默了PHGDH或PSAT1的表达。被抑制的PHGDH或PSAT1通过一定程度上依赖下调PHGDH或PSAT1水平的方式废除了G9A促进细胞增殖的能力。事实上,超过90%的PHGDH或PSAT1被抑制的G9A超量表达细胞,都不能在最初缺乏而随后补充丝氨酸的情况下增殖。我们用G9A超量表达的SHEP1细胞获得本质上一样的结果。总体的,这些数据表明,G9A通过转录激活丝氨酸-甘氨酸生物合成通路促进细胞增殖。