论文部分内容阅读
目的：翼状胬肉是一种常见的眼表疾病，且术后复发率较高。作为一种遗传和环境因素互作引发的类瘤性疾病，翼状胬肉的发生符合表观遗传性疾病的特点。越来越多的研究者开始探索miRNA在翼状胬肉中的作用。miRNA网络参与了翼状胬肉疾病发展过程中众多病理过程的调控，比如细胞凋亡、迁移、上皮细胞间质化(epithelial–mesenchymal transition，EMT)等，但是miRNA参与翼状胬肉的分子机制尚未阐明，因此本研究的目的在于：
(1)发现翼状胬肉中新的异常表达的miRNA；
(2)探究筛选出的差异表达的miRNA在翼状胬肉中的作用及分子机制。
方法：(1)在3对翼状胬肉和对照结膜组织中，利用miRNA芯片技术初步筛选出在翼状胬肉中差异表达的miRNA，结合文献选取靶miRNA。生物信息学过滤筛选miRNA的靶基因，miRNA及其靶基因之间的结合关系通过双荧光素酶实验确定。(2)体外培养人正常结膜上皮细胞(HCE)，并在一定的浓度和时间条件下用TGF-?和EGF诱导HCE出现结膜上皮细胞的EMT模型(EMT-HCE)。用蛋白免疫印迹(westernblot，WB)和免疫荧光检测的方法检测EMT标志物，验证模型是否构建成功。(3)在HCE中过表达miRNA或敲降靶基因，在EMT-HCE中抑制miRNA的表达或者过表达靶基因，通过细胞划痕实验和迁移实检测上述处理前后上皮细胞迁移能力的改变，流式细胞术检测细胞凋亡水平。回补实验验证miRNA、靶基因和EMT三者的关系。(4)在大样本组织中，用实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR，qPCR)和WB的方法验证miRNA、靶基因的表达情况及二者间的关系。(5)生物信息学预测miRNA及其靶基因可能参与的信号通路。
结果：(1)芯片结果显示miR-199a-3p和miR-199a-5p在翼状胬肉中表达上调，生物信息学预测DUSP5和MAP3K11分别是miR-199a-3p和miR-199a-5p的靶基因，双荧光素酶实验证实miRNA与其相应的靶基因在HCE中的确存在直接结合作用(2)在10nM的TGF-?和20nM的EGF的共同作用之下，诱导7d后HCE成梭形样贴壁生长，呈现EMT表型。WB和免疫荧光结果显示诱导后的EMT-HCE的间质细胞表面标志物增多，上皮细胞表面标志物减少，且上皮细胞伴随EMT的发生出现迁移能力增加、细胞凋亡减少的特点。(3)miR-199a-3p和miR-199a-5p能够促进HCE中EMT的发生。而过表达靶基因DUSP5或MAP3K11则会抑制EMT的发生。回补实验结果显示，miR-199a-3p或miR-199a-5p的过表达能够进一步促进TGF-?和EGF诱导的EMT，而同时过表达DUSP5或MAP3K11则会减弱miR-199a对EMT-HCE中EMT的促进作用。(4)在翼状胬肉大样本中验证了组织中miR-199a家族的高表达(miR-199a-3p/miR-199a-5p：p＜0.0001)。和其相应靶基因DUSP5和MAP3K11的低表达(DUSP5/MAP3K11：p<0.001)，且miR-199a与其相应靶基因的表达成负相关(miR-199a-3p和DUSP5：R=-0.1586，p=0.0249；miR-199a-5p和MAP3K11：R=-0.3237，p=0.0024)。(5)生物信息学分析结果提示miR-199a通过抑制其靶基因的表达，参与了MAPK信号通路的调控。
结论：(1)10nMTGF-β和20nMEGF处理7d，能够在HCE中成功诱导出典型的结膜上皮细胞EMT模型，我们推测TGF-β和EGF是翼状胬肉EMT发生的诱因。(2 )miR-199a-3p/5p可能通过抑制MAPK信号通路中的DUSP5/MAP3K11分子，促进TGF-β和EGF诱导的翼状胬肉中EMT的发生和发展。我们的研究将为翼状胬肉未来的防治工作提供新思路和新途径。
(1)发现翼状胬肉中新的异常表达的miRNA；
(2)探究筛选出的差异表达的miRNA在翼状胬肉中的作用及分子机制。
方法：(1)在3对翼状胬肉和对照结膜组织中，利用miRNA芯片技术初步筛选出在翼状胬肉中差异表达的miRNA，结合文献选取靶miRNA。生物信息学过滤筛选miRNA的靶基因，miRNA及其靶基因之间的结合关系通过双荧光素酶实验确定。(2)体外培养人正常结膜上皮细胞(HCE)，并在一定的浓度和时间条件下用TGF-?和EGF诱导HCE出现结膜上皮细胞的EMT模型(EMT-HCE)。用蛋白免疫印迹(westernblot，WB)和免疫荧光检测的方法检测EMT标志物，验证模型是否构建成功。(3)在HCE中过表达miRNA或敲降靶基因，在EMT-HCE中抑制miRNA的表达或者过表达靶基因，通过细胞划痕实验和迁移实检测上述处理前后上皮细胞迁移能力的改变，流式细胞术检测细胞凋亡水平。回补实验验证miRNA、靶基因和EMT三者的关系。(4)在大样本组织中，用实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR，qPCR)和WB的方法验证miRNA、靶基因的表达情况及二者间的关系。(5)生物信息学预测miRNA及其靶基因可能参与的信号通路。
结果：(1)芯片结果显示miR-199a-3p和miR-199a-5p在翼状胬肉中表达上调，生物信息学预测DUSP5和MAP3K11分别是miR-199a-3p和miR-199a-5p的靶基因，双荧光素酶实验证实miRNA与其相应的靶基因在HCE中的确存在直接结合作用(2)在10nM的TGF-?和20nM的EGF的共同作用之下，诱导7d后HCE成梭形样贴壁生长，呈现EMT表型。WB和免疫荧光结果显示诱导后的EMT-HCE的间质细胞表面标志物增多，上皮细胞表面标志物减少，且上皮细胞伴随EMT的发生出现迁移能力增加、细胞凋亡减少的特点。(3)miR-199a-3p和miR-199a-5p能够促进HCE中EMT的发生。而过表达靶基因DUSP5或MAP3K11则会抑制EMT的发生。回补实验结果显示，miR-199a-3p或miR-199a-5p的过表达能够进一步促进TGF-?和EGF诱导的EMT，而同时过表达DUSP5或MAP3K11则会减弱miR-199a对EMT-HCE中EMT的促进作用。(4)在翼状胬肉大样本中验证了组织中miR-199a家族的高表达(miR-199a-3p/miR-199a-5p：p＜0.0001)。和其相应靶基因DUSP5和MAP3K11的低表达(DUSP5/MAP3K11：p<0.001)，且miR-199a与其相应靶基因的表达成负相关(miR-199a-3p和DUSP5：R=-0.1586，p=0.0249；miR-199a-5p和MAP3K11：R=-0.3237，p=0.0024)。(5)生物信息学分析结果提示miR-199a通过抑制其靶基因的表达，参与了MAPK信号通路的调控。
结论：(1)10nMTGF-β和20nMEGF处理7d，能够在HCE中成功诱导出典型的结膜上皮细胞EMT模型，我们推测TGF-β和EGF是翼状胬肉EMT发生的诱因。(2 )miR-199a-3p/5p可能通过抑制MAPK信号通路中的DUSP5/MAP3K11分子，促进TGF-β和EGF诱导的翼状胬肉中EMT的发生和发展。我们的研究将为翼状胬肉未来的防治工作提供新思路和新途径。