随着我国食品安全问题愈发受到重视和食品工业的不断进步，食品工业产品必将摒弃终端控制而转向过程控制，发酵乳作为生产工艺自动化程度较高的一类食品，污染菌和致病菌检测体系和溯源技术就显得尤为重要，因为化学污染物可以通过原料控制、工艺控制等环节实现控制甚至杜绝，而污染菌和致病菌存在很大程度的不可控性。本研究将发酵乳常见的污染菌和致病菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌、葡萄糖杆菌、葡糖醋杆菌和植物乳杆菌）作为研究对象，将过程控制结合终端产品作为研究过程，通过特异性的选择培养基、绝对定量的数字PCR技术、适用性强的依赖解旋酶等温扩增技术建立发酵乳中污染菌和致病菌的检测体系，并通过高通量的二代测序技术完成发酵乳中污染菌和致病菌溯源技术的初步研究。　　醋酸菌科特异性选择培养基:葡萄糖50g/L，牛肉膏5g/L，酵母粉10 g/L，乙醇10mL/L，pH值6.8，0.1％胆盐，1％瑞士染液。葡糖醋杆菌呈现紫黑色、有明显的透明圈;醋化醋杆菌呈现酒红色、无明显的透明圈;葡糖杆菌呈现粉红色、无明显的透明圈。　　建立了活菌提取方法，通过Reagent D去除死菌，比较三种细菌基因组DNA提取方法，筛选得出FoodProof磁珠法提取细菌DNA杂质最少纯度最高。建立发酵乳中8株污染菌和致病菌的ddPCR检测方法，确定ddPCR反应体系为:2×ddPCR SuperMix10μL，1.2μL上下游引物（10μmol/L），0.4μL探针(10μmol/L)，4.4μL的模板，灭菌双蒸水补足20μL。确定ddPCR的反应程序:95℃预变性，10min;94℃变性，1min;56℃退火，45s;进行40个循环，98℃10min。上述8株污染菌和致病菌的较适退火温度分别为54℃、50.2℃、50.7℃、52.6℃、54.6℃、54℃、52.4℃、52.7℃。ddPCR方法检测上述8株污染菌和致病菌特异性良好，非靶标菌株无扩增现象。人工污染发酵乳后，上述8株污染菌和致病菌生物检测灵敏度分别为61CFU/g、33 CFU/g、9.5CFU/g、81 CFU/g、72CFU/g、8.8CFU/g、89 CFU/g、96CFU/g。比较上述8株污染菌和致病菌的ddPCR检测拷贝数和计数菌落数的偏差均在25％以内，且104 CFU/g以内与常规计数结果保持良好的线性关系(标准曲线R2均大于0.99)，证明ddPCR检测酸奶中污染菌和致病菌绝对定量的准确性。　　建立发酵乳中8株污染菌和致病菌的HDA检测方法，确定该方法反应体系为:5μL10×buffer(100mM二硫苏糖醇、350 mM Tris-HAc、100mM MgSO4、1mg/mLBSA),0.04μM dNTPs,0.16μMATP,10U Bst ploymerase,0.1μg UvrD helicase,5.0μgT4 gp32，25μM海藻糖，2μL模板DNA，20 pmol引物，用ddH2O补至50μL（其中上述8株污染菌和致病菌较适UvrD helicase、T4 gp32终浓度分别为0.1μg、5.0μg;0.1μg、5.0μg;0.1μg、4.0μg;0.1μg、5.0μg;0.15μg、4.0μg;0.1μg、5.0μg;0.1μg、5.0μg;0.15μg、5.0μg）。反应条件为:65℃恒温2h。HDA方法检测上述8株污染菌和致病菌特异性良好，非靶标菌株无扩增现象，经测序比对，同源性均为100％。发酵乳经人工污染后，上述8株污染菌和致病菌生物检测灵敏度分别为2.6×102 CFU/g、3.3×101 CFU/g、2.3×101 CFU/g、1.6×101 CFU/g、6.8×101 CFU/g、4.3×101 CFU/g、1.0×102CFU/g、2.8×101 CFU/g。初步对HDA方法进行了改良，将T4 gp32蛋白替换为终浓度为3.0μg RecA蛋白和加入10U Phi29嗜温聚合酶可以缩短HDA法检测时间，提高检测速率;而多胺没有作用;确定了肉眼可见较适的短链DNA直观检测SYBR GreenⅠ终浓度为40×。　　初步建立了发酵乳中污染菌和致病菌鉴定与溯源技术的研究方法，设置了原料乳、辅料、车间空气、手部涂抹、工装、包材、灌注管、成品共计8个采样点，通过采样点的处理、不同采样点的标记、二代测序，获得530673条有效序列，长度471bp的序列为529346条。测序结果的稀释曲线能够涵盖8个采样点中足够多的细菌类别，具有充足的测序深度。测序结果的丰度和多样性指数(Chao1、Ace、Shannon、Simpson)显示测序结果能够真实的反应样品中的微生物种群分布情况。原料乳采样环节属水平菌群结构分布较为均匀，辅料采样环节属水平菌群结构较为复杂，车间空气采样环节属水平菌群结构分布相对单一，手部涂抹采样环节属水平菌群结构分布较为均衡且种类较多，工装采样环节属水平菌群结构分布较为平均，包材采样环节属水平菌群结构分布不均衡，灌注管采样环节属水平菌群结构分布较为单一，成品采样环节属水平菌群结构分布主要以乳杆菌属、链球菌属为主。溯源分析结果显示，葡萄球菌属的关键控制点的危害强度:工装＞车间空气＞手部涂抹＞灌注管＞原料乳、辅料;葡糖杆菌属的关键控制点的危害强度:手部涂抹＞原料乳。　　发酵乳中污染菌和致病菌检测体系和溯源技术是大中型发酵乳生产企业所急需的，本项目研究是一次十分有益的尝试，对食品生产、食品监管都均有重要的意义，能够为其它食品污染菌和致病菌标准化控制体系提供有益的示范作用。