一、研究背景　　近年来,流行病学调查显示,世界范围内的糖尿病发病率由2％上升到5%。特别是在一些发展中国家,例如中国,经济的迅速发展伴随着生活模式和生活环境的变化,使糖尿病的发病率每年增长3%。1型糖尿病(type1diabetes,T1D)又名胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)或青少年糖尿病,是儿童与青少年常见的内分泌疾病。1型糖尿病是易感个体在环境因素的诱导下,由Th1细胞介导,以免疫性胰岛炎和胰岛β细胞受损为主要特征的自身免疫性疾病。2型糖尿病主要发生于成人,是由于体内高糖高脂毒性对β细胞的长期损害所致,表现为胰岛素抵抗和肥胖。外源性胰岛素治疗不能像自身分泌的内源性胰岛素那样精确地调节血糖水平,所以,糖尿病患者常伴有多种并发症:糖尿病肾病、酮症酸中毒、非酮症性高渗性昏迷、糖尿病性心脏病、糖尿病性脑血管病变、糖尿病性肢端坏疽、糖尿病性神经病变等。并且,糖尿病病情迁延,难以根除,需长期用药,导致家庭和社会负担沉重。我国用于治疗糖尿病的医疗支出约占医疗卫生总费用4%~5%。　　1型和2型糖尿病的发病机制至今尚未明确,但大量的研究证实氧化应激(Oxidativestress)和内质网应激(ERstress)在β细胞损坏导致糖尿病过程中发挥重要作用。氧化应激是导致β细胞损伤、凋亡的主要病理基础。在正常状态下机体可产生少量活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS),同时存在自由基清除体系,使自由基的产生和清除保持平衡。少量活性氧自由基参与代谢,如细胞内的信号转导,调控细胞的生长、分裂、分化、迁移、凋亡及衰老等生理活动,但过多活性氧自由基可导致组织、细胞发生病理改变,造成的机体伤害。胰腺β细胞抗氧化防御能力低下,细胞内自由基清除酶(Cu/Zn超氧化物歧化酶、Mn超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶)和ROS清除蛋白(硫氧化还原蛋白)水平较低,使较低的氧自由基浓度即可使胰腺β细胞受损。　　内质网应激是导致β细胞损伤、凋亡的另一个重要机制。β细胞作为内分泌细胞,拥有高度发达的内质网系统,同时也使β细胞对内质网应激高度敏感。在氧化应激等情况下,内质网内未折叠蛋白增多,发生未折叠蛋白反应(Unfoldproteinresponse,UPR),该反应首先激活膜上的3个信号蛋白:PERK(PKR-likeERkinase,双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶),IRE-1(inositolrequiringenzyme1,跨膜蛋白激酶1)和ATF6(Activatingtranscriptionfactor6,活化转录因子6),通过其下游信号通路抑制蛋白质的合成,上调分子伴侣和折叠蛋白的表达,加速未折叠蛋白的降解等多种方式缓解内质网应激状态。当UPR超过细胞的承受能力,使细胞不能重新回到稳态时,则会启动细胞凋亡程序。通过CHOP通路、IRE1-TRAF2-ASK1-caspase12通路和Ca2+通路,使细胞发生凋亡。　　氧化应激和内质网应激所致β细胞损伤是引发及推动1型和2型糖尿病的重要环节,两者分别/共同作用,使β细胞失去分泌胰岛素的功能。本课题组的前期及其它课题组研究结果显示,在氧化应激和内质网应激状态下,SUMO高表达,多种抵抗应激的蛋白被SUMO化,显示蛋白SUMO化是一种重要的转录后抵抗应激的调节机制。　　SUMO化修饰过程与泛素化类似,包含E1活化酶,E2结合酶以及E3连接酶三个酶的级联反应。E1活化酶是一种异源二聚体,在哺乳动物中为SAE1/SAE2,E2结合酶为UBC9,UBC9是SUMO化修饰中唯一的E2结合酶,UBC9的表达变化直接影响到SUMO化功能,因此,UBC9是研究β细胞SUMO化功能的良好靶点。UBC9基因缺乏会导致小鼠胚胎期死亡。E3酶主要包括三类:PIAS家族、核孔蛋白RanBP2/Nup358和Pc2。通过三种酶的级联反应SUMO分子被转移至底物蛋白。　　本研究以UBC9为靶点,以诱导型条件性UBC9基因敲除小鼠,在成年小鼠β细胞内特异性地敲除UBC9基因作为模型,研究SUMO化修饰对β细胞功能的影响,进行了以下工作:　　二、诱导型UBC9基因敲除小鼠模型的建立　　本研究用ubc9fl/fl小鼠和他莫昔芬诱导型β细胞特异性RipCreER转基因小鼠进行杂交,建立RipCreER+ubc9fl/fl小鼠。对8周龄RipCreER+ubc9fl/fl小鼠腹腔注射他莫昔芬(50mg/kg/天),每天一次,连续5天,以注射玉米油溶剂(含10%乙醇)的同窝同性别小鼠作为对照,诱导成年小鼠的β细胞UBC9基因敲除。注射完成5天后处死小鼠,由胆总管向胰腺注入胶原酶P,消化挑拣胰岛。提取胰岛的DNA和蛋白,进行PCR和Westernblot分析胰岛的基因组型别及UBC9的表达,验证基因敲除效果。结果显示:对照组小鼠胰岛UBC9基因完整,表达UBC9蛋白高,而他莫昔芬组诱导组胰岛中染色体UBC9基因部分缺失,未检出UBC9蛋白表达,表明他莫昔芬诱导后,RipCreER+ubc9fl/fl小鼠UBC9表达缺失;并且雌性小鼠的诱导完全缺失的比率为50%,雄性小鼠的诱导完全缺失的比率为75%。　　三、UBC9缺失导致小鼠早期发生糖耐量异常,晚期罹患1型糖尿病　　1、UBC9基因敲除小鼠早期发生糖耐量异常　　(1)UBC9基因敲除小鼠糖耐量降低:他莫昔芬或玉米油注射完毕后第9天(D9)行葡萄糖耐量实验,实验前小鼠空腹16小时,腹腔注射2g/kg葡萄糖溶液后于0min、30min、60min、90min、120min和180min采集小鼠尾部血样检测各时间点的血糖值。结果显示:①他莫昔芬组小鼠空腹血糖值较对照油组明显降低;②对照组小鼠血糖30min升到峰值,60min迅速下降,90min基本恢复到正常,而他莫昔芬组小鼠血糖30min峰值明显升高,60-120min血糖缓慢下降,180min时尚未恢复正常。　　(2)UBC9基因敲除小鼠胰岛素耐受正常:胰岛素的分泌减少与胰岛素抵抗均可造成糖耐量下降,为了进一步明确他莫昔芬组引起糖耐量下降的原因,我们比较了两组小鼠的胰岛素耐受情况。腹腔注射0.75U/kg胰岛素,于注射后0min、15min、30min、45min和60min检测血糖。结果显示:两组小鼠0min的随机血糖值无差异,30min时血糖均降到最低点,60min时血糖基本恢复正常,各时间点组间差异不显著。　　以上两个实验表明:胰岛β细胞特异性UBC9基因缺失导致β细胞分泌胰岛素的功能明显下降,造成糖耐量异常。　　2、UBC9基因敲除小鼠晚期血糖自发升高,血清胰岛素水平下降,出现自发糖尿病　　(1)UBC9基因敲除小鼠平均血糖值升高:监测他莫昔芬组和对照组小鼠的随机血糖值,一周2次。D7到D42天两组小鼠平均血糖持续在正常水平,他莫昔芬组血糖略高于对照组,但组间差异不显著;D42天之后,他莫昔芬组血糖值持续上升,D70天达478.6±12.4mg/dl,较对照组166.3±6.0mg/dl明显升高。　　(2)UBC9基因敲除小鼠血清胰岛素水平下降:采集小鼠心脏血液,ELISA检测血清胰岛水平,与对照组相比,他莫昔芬组小鼠血清胰岛素水平在D45天之后明显下降。　　(3)UBC9基因敲除小鼠糖尿病晚期发病率100%:他莫昔芬组小鼠在D43天开始出现血糖异常,D55天有66.7%小鼠血糖达到糖尿病标准,D65天所有小鼠均出现血糖异常和糖尿病相关症状,而对照组小鼠无1例发病。　　以上结果显示:胰岛β细胞特异性UBC9缺失可导致胰岛素分泌水平下降,造成血糖升高,长时间血糖升高在晚期造成小鼠罹患糖尿病。　　四、UBC9缺失导致胰岛形态和功能异常,β细胞发生凋亡　　1、胰腺组织内胰岛团变小,数目减少:小鼠胰腺石蜡切片HE染色示:对照组胰腺组织胰岛团大而圆,胞浆胞核着色均匀;他莫昔芬组胰岛团随着UBC9敲除时间的后移逐渐变小,并出现凋亡小体。胰岛素免疫组化染色和免疫荧光染色示:对照组胰岛素阳性染色的β细胞团大、圆,占整个切片胰腺组织面积的2%左右;他莫昔芬组胰岛素阳性染色细胞团逐渐减小,D45天仅占切片胰腺组织面积的0.9%;D75天减小到0.2%以下。结果显示:胰岛β细胞特异性UBC9缺失导致胰岛β细胞形态异常,数量减少。　　2、胰岛细胞功能异常:胶原酶P消化获得胰岛,体外培养过夜,进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)实验,检测胰岛在低糖(3.3mM)和高糖(16.7mM)刺激下胰岛素的释放量。他莫昔芬组胰岛分泌能力明显下降。　　3、胰岛内β细胞发生凋亡:TUNEL和cleavedcaspase3染色检测显示他莫昔芬组D45天左右胰岛内2.3%的β细胞发生凋亡,对照组内仅见0.2%的凋亡细胞,组间差异显著。结果提示:胰岛β细胞特异性UBC9缺失使β细胞更容易发生凋亡。　　五、UBC9缺失小鼠对STZ诱导糖尿病的耐受力降低　　他莫昔芬和对照组小鼠腹腔内连续5天注射低剂量STZ(40mg/kg),两组小鼠随机血糖值均缓慢上升,他莫昔芬组血糖明显高于对照组,上升到近600mg/dl,而对照组血糖仅上升到近400mg/dl。结果提示:胰岛β细胞特异性UBC9缺失的β细胞对STZ耐受力明显降低。　　六、UBC9缺失导致β细胞凋亡的机制　　1、SUMO-NADPH氧化酶-ROS途径对β细胞凋亡的影响　　(1)UBC9基因缺失早期β细胞内ROS升高:UBC9基因敲除后D10天,胶原酶消化分离胰岛,培养过夜,细胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN-γ)混合刺激6小时,25μM羧基-H2DCFDA中孵育30min,他莫昔芬组胰岛内ROS荧光强度明显高于对照组。结果说明:胰岛β细胞特异性UBC9缺陷在早期可导致β细胞内ROS表达增强。　　(2)UBC9基因缺失后期β细胞内ROS降低:UBC9基因敲除后D30-D45天,胰岛培养过夜,细胞因子刺激6小时,H2DCFDA中孵育30min,他莫昔芬组胰岛内ROS荧光强度明显低于对照组。结果说明:胰岛β细胞特异性UBC9缺陷导致β细胞大量损伤、凋亡,在诱导后期胰岛内ROS表达减弱。　　2、Ubc9基因缺陷导致β细胞内质网应激　　我们检测了β细胞内ERstress相关蛋白Grp78、Grp58、eIf2a、ATF6、IRE1a和CHOP等蛋白的表达,结果显示:ERstress可能介导了β细胞凋亡。　　七、结论　　1、UBC9基因缺失早期小鼠发生糖耐量异常,后期血糖升高,血清胰岛素水平下降,基因敲除小鼠全部自发糖尿病;　　2、UBC9基因缺陷导致小鼠胰岛内β细胞凋亡,引发胰岛形态和功能异常;　　3、UBC9基因缺陷小鼠对STZ诱导糖尿病的耐受力降低;　　4、UBC9基因缺陷小鼠β细胞内ROS和ERstress的异常表达是导致β细胞损伤、凋亡的重要原因。　　综上所述,SUMO化修饰对胰岛内β细胞的功能和活性起保护作用,该机制可能是通过SUMO1抑制NADPH氧化酶产生的ROS发挥的,同时,ERstress参与其中。去除SUMO化修饰,将导致β细胞凋亡,发生糖尿病。因此,SUMO化修饰的唯一E2结合酶UBC9可能成为临床治疗糖尿病的干预靶点。