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农业害虫是影响农业生产的重要自然灾害，目前化学杀虫剂仍是防治农业害虫的重要手段。化学农药的不合理使用会产生害虫抗药性、农药残留、环境污染等问题。因此，高效低毒的植物源农药的开发及增产成为研究的热点。目前商品化开发最成功的植物源农药——印楝素，由于产量低、结构复杂、合成途径不清晰等问题限制了它的应用和推广。研究、揭示印楝素生物合成途径及其代谢调控，对于构建印楝素异源生物合成平台，实现印楝素的异源生物合成，具有重要的科学意义;对于高产印榇素的印楝育种，也具有参考价值。
本文主要研究印楝素A无细胞合成体系，明确印楝素A的合成前体，推测印楝素A生物合成途径。以愈伤组织为对象，研究诱导子茉莉酸甲酯和前体物质鲨烯对印楝素A合成的影响，并利用转录组和代谢组技术，研究茉莉酸甲酯和鲨烯对印楝愈伤组织代谢的影响，探索印楝素A合成的调控机理。主要研究结果如下:
(1)构建了印楝素A无细胞合成体系，完善了从鲨烯到印楝素A的生物合成途径。
以鲨烯为底物，从缓冲液类型、浓度、起始pH、提取时间及料液比5个方面优化印楝素A无细胞合成体系的制备条件:以pH7.0的200mmol·L-1Tris-HCl缓冲液为提取溶液，料液比1∶20，4℃提取1h。从反应终止试剂及稳定剂、反应温度、反应时间及底物浓度以及辅助因子组合5个方面完善了印楝素A无细胞合成体系反应条件:反应总体系800此，其中印楝无细胞提取物300μL(相当于印楝叶0.015g)，100μL250μmol·L-1的底物和400μL含有1mmol·L-1Mg2+、1mmol·L-1Mn2+、0.1mmol·L-1ATP、0.1mmol·L-1NADPH+和5mmol·L-1抗坏血酸的缓冲液，在30℃下反应60min，用200μL乙酸结束反应。
利用建立的印楝素A无细胞合成体系，以7种萜类物质为底物，研究印楝素A的合成前体。结果表明，大戟二烯醇、Nimbin、脱乙酰茄碱苷、茄碱苷、2,3-环氧鲨烯和丁酰鲸鱼醇是印楝素A的合成前体，且茄碱苷位于印楝素A合成途径的较下游位置;羊毛甾醇不是印楝素A的合成前体。在实验的基础上，推测、绘制了从鲨烯到印楝素A的生物合成途径。
(2)明确了鲨烯和茉莉酸甲酯对印楝素A生物合成的影响。
鲨烯和茉莉酸甲酯显著促进印楝素A的生物合成。愈伤组织在红蓝光(1618h L/D)光照下培养24h，与对照相比，添加500μmol·L。鲨烯和100μmol·L。茉莉酸甲酯可分别提高印楝素A产量79.1％和73.0％。进一步研究表明两者对印楝素A的合成有协同增效作用，同时添加500μmol·L-1鲨烯和100μmol·L-1茉莉酸甲酯，红蓝光(16/8h L/D)照射培养24h，愈伤组织中印楝素A的产量提高139.0％。
鲨烯对愈伤组织中4种未知化合物的合成也有促进作用，结合质谱信息初步鉴定其中3种化合物为1-Senecioyl-3-acetylvilasininlactol presumably、1-Detigloyl-1-isobutyroyl-epoxymethacroylazadirachtin和Nimbosodione，其中1-senecioyl-3-acetylvilasininlactol presumably可能参与印楝素A的合成。
(3)初步揭示了茉莉酸甲酯和鲨烯对印楝素A生物合成相关代谢网络的影响。
基于广泛靶向代谢组技术，检测到茉莉酸甲酯、鲨烯以及两者共同处理的印楝愈伤组织的代谢产物共767种，其中差异代谢物的数目分别为132、137和132种。茉莉酸甲酯、鲨烯和两者共同处理均显著影响有机酸、氨基酸及其衍生物和苯丙烷及其衍生物的代谢。与鲨烯相比，茉莉酸甲酯对脂质调控明显，而鲨烯对胺类物质的代谢影响更大。
基于差异代谢物的分析，本研究绘制了茉莉酸甲酯和鲨烯调控印楝素A生物合成的代谢网络。茉莉酸甲酯通过促进Entner-Doudomffpathway反应、糖酵解等初生代谢，降低固醇类物质的次生代谢调控印楝素A的合成。鲨烯影响Entner-Doudoroffpathway反应和糖酵解，并通过干预三羧酸循环、脂质代谢以及结构修饰相关酶的活性影响印楝素A的合成。
7种柠檬苦素类物质代谢分析表明鲨烯促进印楝素H的合成，茉莉酸甲酯对印楝素D和印楝素H的合成有一定程度的抑制，两者均抑制印楝素B的合成。进一步证明了Nimbin和Salannin是印楝素A生物合成途径的中间代谢物，Azadiradione可能参与了印楝素A的合成。
(4)初步阐明茉莉酸甲酯和鲨烯调控印楝素A生物合成的机制。
茉莉酸甲酯、鲨烯以及两者共处理的印楝愈伤组织转录组测序共获得96.88GbClean Data，组装得到44313个Unigene，其中25038个Unigene在数据库注释信息。茉莉酸甲酯、鲨烯及两者共同处理组分别获得261、32和316条差异表达基因。通过常见数据库比对分析，注释得到560条差异表达基因的功能信息。茉莉酸甲酯对印楝生长发育、代谢、酶活性以及激素的信号传导等有调控作用，鲨烯对印楝的代谢、酶催化及信息传导等方面有影响。两者的协同作用对印楝生长发育、代谢及催化等方面影响更加显著，调控范围涉及更广。
基于转录组学和代谢组学联合分析，本研究初步阐释了茉莉酸甲酯和鲨烯调控印楝素A生物合成的机制。茉莉酸甲酯调控Entner-Doudoroffpathway反应和糖酵解反应的进行，促进乙酰CoA、丙酮酸和3-磷酸甘油醛的合成，进而引起萜类合成中1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-lxyluloses-phosphatereduetoisomerase，DXR)、甲基戊二酰CoA还原酶(hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGR)和鲨烯环氧酶(squalene epoxidase，SQLE)基因的高表达，推动印楝素A的合成，同时茉莉酸甲酯抑制固醇类物质的合成，促使更多的鲨烯进入印楝素A的代谢通路中。鲨烯除了以前体物质参与印楝素A的合成，调控Entner-Doudoroff pathway反应和糖酵解，还通过影响乙酰CoA的合成和结构修饰相关酶的活性调控印楝素A的合成。
综上所述，本研究构建了印檬素A无细胞合成体系，明确了2，3-环氧鲨烯、大戟二烯醇、丁酰鲸鱼醇、脱氧茄碱昔、茄碱苷和Nimbm等6种物质是印楝素A的合成前体，通过实验进一步完善了从鲨烯到印楝素A的生物合成途径，基于代谢组学和转录组学研究，初步揭示了茉莉酸甲酯和鲨烯对印楝愈伤组织生物合成印楝素A的影响及其调控机制。研究结果为最终阐明印楝素生物合成途径，指导构建印楝素异源生物合成平台，实现印楝素的异源生物合成，奠定了基础。
本文主要研究印楝素A无细胞合成体系，明确印楝素A的合成前体，推测印楝素A生物合成途径。以愈伤组织为对象，研究诱导子茉莉酸甲酯和前体物质鲨烯对印楝素A合成的影响，并利用转录组和代谢组技术，研究茉莉酸甲酯和鲨烯对印楝愈伤组织代谢的影响，探索印楝素A合成的调控机理。主要研究结果如下:
(1)构建了印楝素A无细胞合成体系，完善了从鲨烯到印楝素A的生物合成途径。
以鲨烯为底物，从缓冲液类型、浓度、起始pH、提取时间及料液比5个方面优化印楝素A无细胞合成体系的制备条件:以pH7.0的200mmol·L-1Tris-HCl缓冲液为提取溶液，料液比1∶20，4℃提取1h。从反应终止试剂及稳定剂、反应温度、反应时间及底物浓度以及辅助因子组合5个方面完善了印楝素A无细胞合成体系反应条件:反应总体系800此，其中印楝无细胞提取物300μL(相当于印楝叶0.015g)，100μL250μmol·L-1的底物和400μL含有1mmol·L-1Mg2+、1mmol·L-1Mn2+、0.1mmol·L-1ATP、0.1mmol·L-1NADPH+和5mmol·L-1抗坏血酸的缓冲液，在30℃下反应60min，用200μL乙酸结束反应。
利用建立的印楝素A无细胞合成体系，以7种萜类物质为底物，研究印楝素A的合成前体。结果表明，大戟二烯醇、Nimbin、脱乙酰茄碱苷、茄碱苷、2,3-环氧鲨烯和丁酰鲸鱼醇是印楝素A的合成前体，且茄碱苷位于印楝素A合成途径的较下游位置;羊毛甾醇不是印楝素A的合成前体。在实验的基础上，推测、绘制了从鲨烯到印楝素A的生物合成途径。
(2)明确了鲨烯和茉莉酸甲酯对印楝素A生物合成的影响。
鲨烯和茉莉酸甲酯显著促进印楝素A的生物合成。愈伤组织在红蓝光(1618h L/D)光照下培养24h，与对照相比，添加500μmol·L。鲨烯和100μmol·L。茉莉酸甲酯可分别提高印楝素A产量79.1％和73.0％。进一步研究表明两者对印楝素A的合成有协同增效作用，同时添加500μmol·L-1鲨烯和100μmol·L-1茉莉酸甲酯，红蓝光(16/8h L/D)照射培养24h，愈伤组织中印楝素A的产量提高139.0％。
鲨烯对愈伤组织中4种未知化合物的合成也有促进作用，结合质谱信息初步鉴定其中3种化合物为1-Senecioyl-3-acetylvilasininlactol presumably、1-Detigloyl-1-isobutyroyl-epoxymethacroylazadirachtin和Nimbosodione，其中1-senecioyl-3-acetylvilasininlactol presumably可能参与印楝素A的合成。
(3)初步揭示了茉莉酸甲酯和鲨烯对印楝素A生物合成相关代谢网络的影响。
基于广泛靶向代谢组技术，检测到茉莉酸甲酯、鲨烯以及两者共同处理的印楝愈伤组织的代谢产物共767种，其中差异代谢物的数目分别为132、137和132种。茉莉酸甲酯、鲨烯和两者共同处理均显著影响有机酸、氨基酸及其衍生物和苯丙烷及其衍生物的代谢。与鲨烯相比，茉莉酸甲酯对脂质调控明显，而鲨烯对胺类物质的代谢影响更大。
基于差异代谢物的分析，本研究绘制了茉莉酸甲酯和鲨烯调控印楝素A生物合成的代谢网络。茉莉酸甲酯通过促进Entner-Doudomffpathway反应、糖酵解等初生代谢，降低固醇类物质的次生代谢调控印楝素A的合成。鲨烯影响Entner-Doudoroffpathway反应和糖酵解，并通过干预三羧酸循环、脂质代谢以及结构修饰相关酶的活性影响印楝素A的合成。
7种柠檬苦素类物质代谢分析表明鲨烯促进印楝素H的合成，茉莉酸甲酯对印楝素D和印楝素H的合成有一定程度的抑制，两者均抑制印楝素B的合成。进一步证明了Nimbin和Salannin是印楝素A生物合成途径的中间代谢物，Azadiradione可能参与了印楝素A的合成。
(4)初步阐明茉莉酸甲酯和鲨烯调控印楝素A生物合成的机制。
茉莉酸甲酯、鲨烯以及两者共处理的印楝愈伤组织转录组测序共获得96.88GbClean Data，组装得到44313个Unigene，其中25038个Unigene在数据库注释信息。茉莉酸甲酯、鲨烯及两者共同处理组分别获得261、32和316条差异表达基因。通过常见数据库比对分析，注释得到560条差异表达基因的功能信息。茉莉酸甲酯对印楝生长发育、代谢、酶活性以及激素的信号传导等有调控作用，鲨烯对印楝的代谢、酶催化及信息传导等方面有影响。两者的协同作用对印楝生长发育、代谢及催化等方面影响更加显著，调控范围涉及更广。
基于转录组学和代谢组学联合分析，本研究初步阐释了茉莉酸甲酯和鲨烯调控印楝素A生物合成的机制。茉莉酸甲酯调控Entner-Doudoroffpathway反应和糖酵解反应的进行，促进乙酰CoA、丙酮酸和3-磷酸甘油醛的合成，进而引起萜类合成中1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-lxyluloses-phosphatereduetoisomerase，DXR)、甲基戊二酰CoA还原酶(hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGR)和鲨烯环氧酶(squalene epoxidase，SQLE)基因的高表达，推动印楝素A的合成，同时茉莉酸甲酯抑制固醇类物质的合成，促使更多的鲨烯进入印楝素A的代谢通路中。鲨烯除了以前体物质参与印楝素A的合成，调控Entner-Doudoroff pathway反应和糖酵解，还通过影响乙酰CoA的合成和结构修饰相关酶的活性调控印楝素A的合成。
综上所述，本研究构建了印檬素A无细胞合成体系，明确了2，3-环氧鲨烯、大戟二烯醇、丁酰鲸鱼醇、脱氧茄碱昔、茄碱苷和Nimbm等6种物质是印楝素A的合成前体，通过实验进一步完善了从鲨烯到印楝素A的生物合成途径，基于代谢组学和转录组学研究，初步揭示了茉莉酸甲酯和鲨烯对印楝愈伤组织生物合成印楝素A的影响及其调控机制。研究结果为最终阐明印楝素生物合成途径，指导构建印楝素异源生物合成平台，实现印楝素的异源生物合成，奠定了基础。