背景　　伤寒沙门菌（Salmonellaenterica serovar Typhi, S. Typhi）是肠杆菌科细菌研究的一种重要模式细菌。伤寒沙门菌感染人类主要引起肠热症，经血流扩散后最终会引起菌血症等其他系统性疾病。沙门菌能在食品、胆结石表面以及吞噬细胞内形成生物膜（Biofilm），抵御低温、干燥、抗生素、低PH、低氧、营养胁迫等苛刻环境而生存，因此形成生物膜已经成为沙门菌在宿主体内、外生成的重要“技能”。以往研究表明，参与沙门菌粘附及形成生物膜的要素有鞭毛（Flagella）、各种菌毛（Fimbriae, Curli）、荚膜多糖（O-antigen capsule）、纤维素（Cellulose）、荚膜异多糖酸（Colanic acid）和BapA蛋白等。而各种与生物膜形成相关的效应蛋白的表达非常复杂，可由多种双组份系统、Sigma 因子、全局调节因子、sRNA等构成复杂的网络化调控，可能还有许多相关的作用分子及作用机制不十分清楚。深入分析和理解伤寒沙门菌生物膜形成机制，对保证食品安全和细菌耐药性的研究都有重要意义。　　目的：　　本研究通过伤寒沙门菌形成生物膜条件下的转录组测序，探查与生物膜形成相关的新的分子，并且对其功能以及影响生物膜形成的机制进行研究。　　方法：　　（1）RNA-seq 提取伤寒沙门菌生物膜细菌以及指数生长期细菌的总RNA，转录组测序后分析数据。　　（2）qRT-PCR 设计基因特异性引物，提取实验株和对照株总RNA，逆转录后实时定量PCR，检测相关基因或ncRNA的表达水平。　　（3）Northern blot 制备地高辛标记的能与ncRNA杂交的特异性探针，提取细菌总RNA，电泳，杂交，显影，检测靶基因的转录水平。　　（4）swimming动力实验 将过夜培养的细菌以新鲜LB液体培养基1:100稀释，继续培养至OD600=0.4，转接1μl菌液至0.2%琼脂半固体平板（加入相应抗生素和诱导剂），37℃正置培养12 h，测量细菌动力圈直径。　　（5）生物膜实验 将过夜培养的细菌以新鲜TSB液体培养基1:100稀释，继续培养至OD600=0.2，吸取200μl 菌液于无菌聚苯乙烯板内，30℃静置培养约96 h，结晶紫染色，测定吸光度，检测菌株生物膜形成能力。　　（6）电镜观察细菌鞭毛 将过夜培养的WT、△surA、△flhD菌株以新鲜TSB液体培养基1:100稀释，继续培养至OD600=0.8，透射电镜观察细菌鞭毛数量。　　（7）LacZ报告基因融合及活性测定 将RprA的启动子区连接到载体pHRP309，该序列位于不含启动子区的β-半乳糖苷酶报告基因的上游，将该重组质粒分别导入WT和surA缺陷株中。将两个重组菌株培养并收集菌体，用试剂盒检测其β-半乳糖苷酶的活性。　　（8）凝胶阻滞实验 PCR扩增flhD启动子区片段，纯化后与RcsB蛋白相互作用，然后琼脂糖凝胶电泳分析RcsB与flhD启动子DNA是否能直接结合。　　（9）Western blot实验 收集各菌株的总蛋白，以抗FljB抗血清为一抗，观察各菌株的鞭毛鞭丝蛋白的表达情况。　　结果：　　（1）RNA-seq差异表达基因功能分类及验证 RNA-seq分析结果发现，伤寒沙门菌生物膜条件下与对数生长期相比有1889个基因表达有差异，表达上调的基因类型集中在细菌外膜蛋白合成和脂肪酸降解基因簇，而表达下调的基因则主要集中在与动力相关的鞭毛及趋化基因。选择部分差异表达基因，用qRT-PCR分析验证，结果与转录组分析结果一致。　　（2）差异表达ncRNA的验证 本次RNA-seq分析共发现有956个可能为新的ncRNA，其中279个在生物膜细菌以及指数生长期细菌中表达有差异。挑选其中63个进行RT-PCR和qRT-PCR分析验证，RT-PCR和qRT-PCR实验结果与转录组测序数据基本一致。用Northern blot初步分析发现6个新ncRNA有明显表达。　　(3）已注释sRNA功能分析 对20个有表达差异的已注释sRNA构建高表达菌株，动力实验以及生物膜实验发现，sRNA S2959高表达后上调伤寒沙门菌动力，而sRNA S1300高表达后伤寒沙门菌动力下调；sRNA S2959和sRNA S3594高表达后伤寒沙门菌生物膜形成能力上调，而sRNA S2977高表达后伤寒沙门菌生物膜形成能力下调。　　（4）伤寒沙门菌sRNA S2959的功能 构建了S2959缺失突变株和过表达菌株，并比较了缺失突变株和过表达菌株的动力和生物膜表型。结果表明，相比于S2959缺失突变株，高表达S2959后，细菌的动力和生物膜形成能力显著提高。qRT-PCR实验结果表明：△S2959-pS2959菌株的鞭毛相关基因（flhD，fliA和fljB）的mRNA水平显著高于△S2959-pBAD菌株，然而其他生物膜形成相关基质基因的mRNA水平没有显著变化。　　（5）周质伴侣蛋白SurA缺陷株构建及动力和生物膜表型分析 用Red同源重组方法成功制备surA缺陷株。动力和生物膜试验结果显示，与WT株相比，surA缺陷株的动力和生物膜形成能力显著降低。电镜观察发现，△surA的鞭毛数量与WT株相比显著减少。　　（6）SurA与Rcs系统对鞭毛表达的影响　　① surA基因缺陷对鞭毛相关基因表达影响 qRT-PCR，Western blot实验结果显示，与WT株相比，surA基因缺陷株中鞭毛相关基因的表达水平均显著下调。　　② surA基因缺陷对Rcs系统活化的影响 β-半乳糖苷酶的活性分析显示，△surA株内sRNA RprAβ-半乳糖苷酶的活性显著高于WT株；qRT-PCR实验结果显示，△surA中sRNA RprA的mRNA水平显著高于WT株。　　③ Rcs系统活化对鞭毛基因表达的影响 用多粘菌素B诱导细菌Rcs系统活化， qRT-PCR观察sRNA RprA和鞭毛相关基因（flhD、fliA和fljB）的表达，结果显示，Rcs系统活化后sRNA RprA表达显著上调，而鞭毛相关基因显著下调。　　④ SurA影响鞭毛表达以及与Rcs系统的关联 通过△surA-pBAD、△rcsB-pBAD、△surA△rcsB-pBAD、双缺陷回补株△surA△rcsB-psurA以及△surA△rcsB-prcsB的动力表型实验发现，△rcsB-pBAD与△surA△rcsB-pBAD株动力水平相当；双缺陷回补株△surA△rcsB-psurA动力表型与双缺陷株△surA△rcsB-pBAD水平相当；双缺陷回补株△surA△rcsB-prcsB动力水平与单缺陷株△surA相当。qRT-PCR实验检测各菌株鞭毛相关基因mRNA水平和Western blot检测鞭毛鞭丝蛋白FljB蛋白水平的结果与表型实验结果一致。　　（7）RcsB与flhD相互作用 EMSA实验结果表明，磷酸化的RcsB蛋白与flhD的启动子区能直接结合。　　（8）鞭毛对细菌生物膜形成影响 细菌生物膜形成能力实验结果显示，鞭毛缺陷菌株△flhD几乎不能形成生物膜。　　结论：　　（1）与指数生长期细菌相比，伤寒沙门菌在生物膜条件下外膜蛋白合成以及脂肪酸代谢相关基因显著上调，而鞭毛合成相关和细菌趋化相关的基因显著下调。　　（2）发现大量新的疑似ncRNA在指数生长期细菌和生物膜细菌中差异表达。　　（3）sRNA S2959高表达能够上调伤寒沙门菌动力，而sRNA S1300高表达下调伤寒沙门菌动力。sRNA S2959和sRNA S3594上调伤寒沙门菌生物膜形成能力，而sRNA S2977下调伤寒沙门菌生物膜形成能力。　　（4）伤寒沙门菌sRNA S2959通过促进鞭毛表达来上调细菌动力和生物膜形成能力。　　（5）伤寒沙门菌周质伴侣蛋白SurA依赖Rcs系统影响细菌鞭毛表达，SurA通过影响鞭毛表达来调控细菌动力和生物膜形成能力。