萝卜黑色根皮花青素合成分子调控机制研究及相关基因克隆

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萝卜(Raphanus sativus L.)为十字花科(Cruciferae)萝卜属(Raphanus)一、二年生草本植物。在长期的进化和选择中,形成了色彩丰富多样的品种类型,而黑萝卜的颜色与传统的萝卜大相径庭,其颜色形成的分子机理尚不清楚。本研究主要对萝卜重组自交系1901(幼苗期b1、皮层分裂期b2、快速膨大期b3、成熟期b4)和1911(成熟期w4)的根皮进行类黄酮代谢组学和转录组学进行分析,旨在解析重组自交系1901萝卜黑色根皮花青素积累的分子机制,筛选调控萝卜黑色根皮花青素合成的hub基因,丰富植物花青素生物合成机制的基础理论,为萝卜遗传改良和种质创新提供依据。本试验主要研究结果如下:(1)通过代谢组学分析,发现萝卜根皮中主要黄酮类代谢物包括黄酮醇、黄酮和花青素等12类代谢物质。花青素有16种,其中12种为矢车菊素及其衍生物,且矢车菊素3-O-葡萄糖苷含量在黑色萝卜的不同发育时期都很高,矢车菊素及其衍生物是导致萝卜根皮呈黑色的主要原因。(2)RNA-Seq分析表明,在w4_Vs_b1、w4_Vs_b2、w4_Vs_b3和w4_Vs_b4中,上调的基因数量多于下调的基因数量。不同发育时期的差异表达基因GO分类分析结果表明差异基因均在生物过程富集最多,在生物过程类别下主要富集在细胞过程、代谢过程、应激反应等条目下;KEGG富集分析表明4组对比中次生代谢物生物合成和代谢途径中差异表达基因最多。通过q RT-PCR分析了相关基因的表达水平,所有候选基因的q RT-PCR结果与RNA-Seq相应的转录丰度基本一致,说明RNA-Seq结果是有效和可靠的。(3)结合类黄酮及花青素生物合成途径(Ko00941、Ko00942)相关基因的表达情况和代谢产物的相对表达量,构建了萝卜黑色根皮中花青素生物合成途径。(4)WGCNA分析表明,在MEindianred2模块中共发现28个结构基因,98个转录因子。在网络图中,共有16个结构基因与10个转录因子具有高度相关性,其中LOC108840410(RsMYB114)、LOC108832389(RsMYB308L)、LOC108838184(Rs TT8)和LOC108806342(Rs WRKY44L)与16个结构基因的节点连通性最高,已有研究表明这4个转录因子均是花青素合成正向调控因子。因此RsMYB114、RsMYB308L、Rs TT8和Rs WRKY44L是萝卜黑色根皮花青素合成的候选基因。(5)对候选基因RsMYB114进行克隆并功能预测,发现RsMYB114的c DNA全长为750 bp,g DNA全长为1635 bp,并且2个萝卜重组自交系1901和1911的序列没有差别。推测的RsMYB114蛋白属于亲水性蛋白,有高度保守的SANT结构域家族及Myb_DNA-binding结构域家族,属于MYB基因家族;系统进化分析表明,RsMYB114转录因子与芜菁的MYB114有着较高的一致性。同时,对RsMYB114基因在萝卜不同组织中的表达水平进行了分析,RsMYB114几乎在黑色萝卜的所有组织中都表达,在根皮中的表达水平高于其他组织,说明RsMYB114在萝卜黑色根皮花青素生物合成中起着重要的作用。
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