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1.研究目的通过“以时测脏”的研究方法,观察对比正常组与模型组(摘除松果体)金黄地鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamus-Pituitary-Adrenal axis,HPA轴)中各层次相关的内分泌物质与褪黑素受体含量的季节性变化,进一步探讨“肾应冬,主封藏”的生物学机制,中医肾藏象的本质内涵及松果体在季节变化过程中的作用,同时希望为临床针对时令季节变化治疗相关脏腑疾病提供实验依据。2.研究方法2.1动物实验健康雄性叙利亚金黄地鼠,(120g±20g),由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。分别于春分、夏至、秋分、冬至前5周购入,随机分为正常组与模型组,每组8只。其中模型组进行松果体摘除手术。正常组与模型组在相同饲养条件下饲养至春分、夏至、秋分、冬至当日,于晚08:00移至暗室,晚09:00开始取材,取出正常组与模型组金黄地鼠血清与下丘脑、垂体、肾上腺组织,用酶联免疫吸附试验(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)法检测各层次内分泌物质指标含量。2.2指标检测2.2.1四季变化对血清及下丘脑-垂体-肾上腺轴组织中相关内分泌物质的影响(1)四季变化对血清中促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT)、肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺髓质素(ADM)分泌的影响;(2)四季变化对下丘脑中促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)分泌的影响;(3)四季变化对垂体中促肾上腺皮质激素(ACTH)含量分泌的影响;(4)四季变化对肾上腺中肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺髓质素(ADM)、醛固酮(ALD)分泌的影响。2.2.2松果体对下丘脑-垂体-肾上腺轴中相关的内分泌物质的调节作用(1)褪黑素(MT)和褪黑素受体(MR)对下丘脑-垂体-肾上腺轴中相关内分泌物质的季节性影响;(2)松果体摘除对下丘脑-垂体-肾上腺轴中相关内分泌物质的季节性影响。2.3分析、统计方法所有数据用均数士标准差(x±s)表示,运用SPSS20.0统计软件分析。组间采用单因素方差分析或K个独立样本的非参数检验方法;两两比较时,用独立样本t检验,或2个独立样本的非参数检验。若P<0.05,具有统计学意义。3.研究结果3.1松果体与HPA腺轴组织中相关的内分泌物质与褪黑素受体含量的四季变化3.1.1松果体组织中褪黑素与褪黑素受体含量的四季变化①正常组金黄地鼠松果体组织MT含量四季变化趋势为夏>秋>冬>春,其中夏季与春秋冬三季存在显著差异(p<0.05)。②正常组金黄地鼠松果体组织MR含量四季变化趋势为春>夏>秋>冬。3.1.2 HPA腺轴组织中相关内分泌物质与褪黑素受体含量的四季变化3.1.2.1下丘脑组织中相关内分泌物质与褪黑素受体含量的四季变化①正常组金黄地鼠下丘脑组织MT含量四季变化趋势为冬>夏>秋>春,其中春冬两季存在显著差异(P<0.05);模型组下丘脑组织MT含量四季变化趋势为夏>秋>冬>春,春夏两季存在显著差异(P<0.05)。②正常组金黄地鼠下丘脑组织MR含量四季变化趋势为夏>冬>秋>春,春夏冬三季存在显著差异(P<0.05);模型组下丘脑组织MR含量四季变化趋势冬>秋>夏>春。③正常组金黄地鼠下丘脑组织中CRH含量四季变化趋势为夏>秋>冬>春,四季均存在显著差异(P<0.001);模型组下丘脑组织中CRH含量四季变化趋势为冬>夏>秋>春,四季均存在差异(P<0.001)。3.1.2.2垂体组织中相关内分泌物质与褪黑素受体含量的四季变化①正常组金黄地鼠垂体组织中MT含量四季变化趋势为夏>春>冬>秋,春夏冬三季存在显著差异,(P<0.01);模型组垂体组织中MT含量四季变化趋势为夏>秋>春>冬,四季均存在极其显著差异(P<0.001)。②正常组金黄地鼠垂体组织MR含量四季变化趋势为夏>秋>春>冬;模型组垂体组织MR含量四季变化趋势为冬>夏>秋>春。③正常组金黄地鼠垂体组织中ATCH含量四季变化趋势为夏>春>冬>秋,夏秋冬三季均存在显著差异(P<0.001);模型组垂体组织中ATCH含量四季变化趋势为秋>夏>冬>春。3.1.2.3肾上腺组织中相关内分泌物质与褪黑素受体含量的四季变化① 正常组金黄地鼠肾上腺组织中MT含量四季变化趋势为冬>夏>秋>春,春冬两季存在显著差异(P<0.05);模型组肾上腺组织中MT含量四季变化趋势为夏>春>秋>冬。②正常组金黄地鼠肾上腺组织中MR含量四季变化趋势为春>冬>秋>夏,四季均存在显著差异(P<0.05);模型组肾上腺组织中MR含量四季变化趋势为秋>夏>冬>春,春夏冬三季均存在差异(P<0.001)。③正常组金黄地鼠肾上腺组织中ALD含量四季变化趋势为夏>秋>冬>春,四季均存在显著差异(P<0.001);模型组肾上腺组织中ALD含量四季变化趋势为夏>秋>冬>春,春夏冬三季有显著差异(P<0.001)。④正常组金黄地鼠肾上腺组织中CORT含量四季变化趋势为夏>秋>冬>春,春夏两季有统计学意义(P<0.05);模型组金黄地鼠肾上腺组织中CORT含量四季变化趋势为夏>秋>冬>春,春夏冬三季有统计学意义(P<0.05)。⑤正常组金黄地鼠肾上腺组织中E含量四季变化趋势为夏>秋>春>冬;模型组肾上腺组织中E含量四季变化趋势为夏>春>冬>秋。⑥正常组金黄地鼠肾上腺组织中NE含量四季变化趋势为夏>秋>春>冬;模型组肾上腺组织中NE含量四季变化趋势为秋>夏>冬>春。⑦正常组金黄地鼠肾上腺组织中ADM含量四季变化趋势为秋>春>冬>夏;模型组肾上腺组织中ADM含量四季变化趋势为夏>秋>冬>春,春夏两季有差异(P<0.05)。3.2血清中与松果体和HPA轴相关内分泌物质含量的四季变化①正常组金黄地鼠血清中MT含量四季变化趋势为冬>秋>春>夏,夏冬两季存在显著差异(P<0.05);模型组血清中MT含量四季变化趋势为冬>秋>春>夏,春秋冬三季存在显著差异(P<0.05)。②正常组金黄地鼠血清中CRH含量四季变化趋势为春>秋>冬>夏,四季均存在显著差异(P<0.05);模型组血清中CRH含量,四季变化趋势为春>冬>秋>夏,四季均有显著差异(P<0.05)。③正常组金黄地鼠血清中ACTH含量四季变化趋势为春>冬>夏>秋,春夏秋三季有统计学意义(P<0.05);模型组血清中ACTH含量四季变化趋势为春>秋>冬>夏,春夏两季有统计学意义(P<0.05)。④正常组金黄地鼠血清中CORT含量四季变化趋势为秋>冬>夏>春,模型组血清中CORT含量四季变化趋势为春>秋>夏>冬。⑤正常组金黄地鼠血清中E含量四季变化趋势为冬>夏>春>秋,秋冬两季存在显著差异(P<0.01);模型组金黄地鼠血清中E含量四季变化趋势为春>秋>夏>冬,春冬两季有差异(P<0.05)。⑥正常组金黄地鼠血清中NE含量四季变化趋势为春>冬>夏>秋,春秋两季存在差异(P<0.01);模型组血清中NE含量四季变化趋势为春>冬>夏>秋,春秋两季有差异(P<0.05)。⑦正常组金黄地鼠血清中ADM含量四季变化趋势为春>秋>夏>冬;模型组血清中ADM含量四季变化趋势为夏>春>秋>冬,春夏冬三季有明显差异(P<0.05)。4.结论(1)中医“肾主封藏”与下丘脑-垂体-肾上腺轴中相关的神经内分泌物质的季节性调节有关。(2)松果体褪黑素对下丘脑-垂体-肾上腺轴中相关的内分泌物质的季节性调节是“肾应冬,主封藏”的重要生物学基础。