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甜瓜是重要的瓜类作物,在世界范围内广泛栽培。近年来,甜瓜白粉病逐渐成为栽培中的主要病害,在露地以及保护地生产条件下,发病后均可导致严重减产,品质下降。常见病原菌主要为瓜单丝壳属白粉菌和二孢白粉菌,瓜单丝壳白粉菌的危害性要大于二孢白粉菌。生产上主要通过常规杂交选育的方法,培育甜瓜抗白粉病品种,但是由于白粉病原菌生理小种的演替速度很快,所以抗病育种往往落后于小种更替。施用化学杀菌剂是目前防控白粉病的主要手段,但又往往损伤了叶片和带来了污染。因此,通过基因工程,创造广谱抗白粉病的甜瓜种质具有非常重要的意义。本研究从甜瓜中克隆到APX和Mlo家族基因,研究了各基因在白粉病胁迫条件的表达,发现APX和CmMlo家族基因在白粉病发病过程中具有一定的相关性,其中CmMlo2在白粉病发病过程中具有重要作用,可能参与了白粉病抗性机制的负调控过程,缺失Mlo会降低白粉病入侵的门槛。将CmMlo2构建了RNA干扰载体,转化甜瓜,获得了抗白粉病的To代转基因植株,实验取得的主要结果如下:1.利用同源序列设计兼并引物,通过RT-PCR方法从甜瓜叶片中克隆到抗坏血酸过氧化物酶APX基因的中间片段,再通过5′RACE和3′RACE分别克隆得到5′端片段和3′端片段,拼接后设计特异引物扩增到全长1012bp cDNA,ORF为750bp,编码249个氨基酸的多肽,分子量大约为27.3kDa。同源序列比对表明,甜瓜APX基因和黄瓜、番茄、玉米、小麦、大麦、拟南芥等APX基因高度同源,将该基因命名为CmAPX,GenBank登录号:EF693949。根据获得的cDNA序列,设计引物,从基因组扩增得到甜瓜APX的gDNA序列,与cDNA序列比对发现CmAPX包含10个外显子,9个内含子,所有内含子均符合GT-AG剪切规则。2.构建了pET24-CmAPX原核表达载体,诱导1、2、3、4、5h后蛋白表达量分别占总融合蛋白的40%、47.5%、50.6%、51.7%、51.6%。表明CmAPX基因在pET24a(+)载体中获得高效表达。表达产物具有APX酶活性,说明CmAPX编码抗坏血酸过氧化物酶基因。3.通过RT-PCR半定量,甜瓜APX基因在不同器官中呈非特异性表达,在叶片中的mRNA含量明显高于根、茎,花及果实。经白粉病诱导0、1、3、5、7d后,表达量在5d时达到最高值,和叶片中酶活性变化一致,表明CmAPX可能参与了白粉病生物胁迫过程。4.根据大麦、拟南芥等Mlo基因的保守序列,设计兼并引物,扩增得到了3个甜瓜Mlo类似中间片段,进一步通过Race技术,获得了3个cDNA全长,分别命名为CmMlo1,CmMlo2和CmMlo3。其中CmMlo1全长1551bp,编码516个氨基酸;CmMlo2全长1713bp,编码570个氨基酸;CmMlo3全长1464bp,编码487个氨基酸序列比对结果表明,CmMlo属于基因家族,和拟南芥的Mlo基因同源性在70%左右。定量和半定量分析结果表明,CmMlo在甜瓜组织中呈特异性表达,在受到白粉病胁迫条件下,CmMlo2表达量上调,CmMlo2可能参与了白粉病发病的负调控过程。5.跨膜蛋白预测表明,CmMlo2为跨膜蛋白。具有7个跨膜螺旋结构。构建pROK-CmMlo2-GFP融合蛋白并转化洋葱表皮细胞,结果表明,CmMlo2蛋白定位于细胞膜。将pROK-CmMlo2-GFP融合蛋白转化烟草,野生型烟草出现了荧光,构建发夹结构pFGC1008-CmMlo2干扰载体,转入荧光烟草可以导致荧光消失,表明干扰载体对靶序列是有效的。6.建立了稳定高效的甜瓜再生体系,优化了甜瓜遗传转化体系,通过农杆菌介导法转化感白粉病甜瓜材料,获得了转化植株。PCR结果及荧光定量分析表明,pFGC1008-CmMlo2已经整合到甜瓜基因组,接种白粉病鉴定表明,转化植株具有白粉病抗性,叶片表面未见白粉病菌丝生长。转化植株出现卷须早,长势较对照(野生型植株)弱,叶片大小、色泽没有明显区别,RNAi植株没有出现明显的生理缺陷。