前言椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是各种脊柱退行性疾病的病理基础,可引起椎间盘突出、椎管狭窄、脊柱稳定性降低等病变。目前,IDD详细的发病机制仍未阐明。当前的研究常常总结为综合因素诱发了 IDD,如遗传、基因多态性、椎间盘髓核细胞功能异常、炎性因子激活、细胞外基质降解、基质金属蛋白酶增多等。值得注意的是,椎间盘组织以髓核(nucleuspulposus,NP)细胞为基础,内源性或外源性因素均先影响髓核细胞的信号通路和生理功能,此外,退变的髓核细胞参与到椎间盘的炎性反应、基质降解和凋亡过程。故,对髓核细胞退变分子机制的研究将有助于阐明IDD的病理机制。越来越多的研究证实,椎间盘髓核细胞可被microRNAs(miRNAs)调控。miRNAs通过调控靶点mRNA的转录,在人体的多种疾病中发挥着不可或缺的作用。目前,在椎间盘退变中,miR-155、miR-193a-3p以及miR-223等miRNAs的作用机制已被广泛报道。Ji ML等通过对IDD组织行Solexa测序后发现miR-486-5p也呈现出明显的倍数变化,具体机制尚未研究。另外,本组初步的靶点预测发现,FOXO1的3’-非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)是miR-486-5p潜在的靶点。作为一类重要的转录因子,FOXO1主要位于细胞核中,通过其翻译后修饰,包括磷酸化、乙酰化、泛素化和其他途径,在多种生理过程中都有重要作用,例如细胞周期和糖脂代谢的调控、细胞凋亡的诱导以及氧化应激的抵抗等过程。近期相关研究也报道了 FOXO1在IDD组织细胞中表达上调,但具体的作用机制尚不清楚。在本研究中,本组首先通过qRT-PCR确定miR-486-5p在IDD样本中的表达情况,进而系统地验证miR-486-5p在体外脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的髓核细胞炎性反应以及体内纤维环穿刺诱导的大鼠髓核退变中的调控作用。通过研究miR-486-5p在IDD中的作用机制,可以有助于理解IDD与miRNA通路之间的关系,有助于将miR-486-5p作为未来新型的诊断标志物或治疗靶点。第一部分miR-486-5p与FOXO1在人髓核组织及LPS诱导的髓核细胞中的表达及意义研究目的1、分别检测健康和IDD髓核组织中miR-486-5p、FOXO1 mRNA及其蛋白的差异性表达;探讨miR-486-5p、FOXO1 mRNA及其蛋白表达与IDD病理分级的关系。2、体外通过人椎间盘髓核细胞的分离与培养明确LPS对人椎间盘髓核细胞凋亡、炎性反应、基质合成以及基质酶表达的作用;构建LPS诱导的髓核细胞退变模型。3、探究LPS刺激后miR-486-5p、FOXO1 mRNA及其蛋白在人椎间盘髓核细胞的表达情况。研究方法1、分别收集30例椎间盘退变病人髓核标本、5例特发性脊柱侧弯患者髓核标本;通过实时定量PCR测定miR-486-5p、FOXO1 mRNA的表达水平;通过Western blot明确两组FOXO1的蛋白表达。2、在无菌条件下分离收集的髓核并将组织修剪成片;用胰蛋白酶和II型胶原酶消化细胞,过滤,离心,弃去上清液,培养细胞。每周更换培养液两次,并在培养期间在倒置显微镜下观察细胞的粘附和生长。3、以不同浓度的 LPS(0、10、100、200、500 ng/ml)刺激细胞;CCK-8检测不同时间点(0、12、24、48 h)的髓核细胞增殖情况,确定LPS的最适刺激浓度及最佳处理时间。4、根据浓度和时间依赖性实验结果,100 ng/ml LPS处理髓核细胞24 h;流式细胞术分析细胞凋亡;qRT-PCR与Western blot检测miR-486-5p、FOXO1 mRNA、FOXO1蛋白以及凋亡蛋白的表达,同时检测相关炎性因子、基质降解酶、Ⅱ型胶原蛋白(collagen Ⅱ)和蛋白聚糖(aggrecan)的mRNA和蛋白的表达。研究结果1、在退变髓核样本中,miR-486-5p表达下调,FOXO1表达上调qRT-PCR与Western blot结果证实,相比于5例健康髓核组织,IDD髓核组织的miR-486-5p表达下调,而FOXO1 mRNA与蛋白表达显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。与退变较轻的髓核相比,miR-486-5p在退变程度较重的髓核组织中表达下调,而FOXO1的mRNA与蛋白表达上调(P<0.05)。此外,miR-486-5p 的表达与 Pfirrmann 分级呈负相关(P=0.019),而 FOXO1 mRNA 与蛋白的表达水平与Pfirrmann分级呈正相关(P=0.021,P=0.024)。2、LPS抑制髓核细胞miR-486-5p表达,诱导FOXO1表达CCK-8结果表明,随着LPS浓度的增加,细胞的增殖能力在一定范围内逐渐减弱,且结果具有时间依赖性和剂量依赖性。当LPS的半抑制浓度为100 ng/ml且刺激时间为24 h时,细胞的增殖能力差异最明显。qRT-PCR与Western blot结果显示,相对于对照髓核细胞,miR-486-5p在LPS诱导的髓核细胞中表达明显下调(P<0.05),而FOXO1 mRNA与蛋白的表达显著上调(P<0.05)。3、LPS诱导髓核细胞炎性因子与基质降解酶表达qRT-PCR与Western blot检测发现,相比于对照组,LPS显著上调髓核细胞中炎性细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)mRNA与蛋白的表达水平;同时,LPS也显著上调 了基质降解酶(MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4 和 ADAMTS-5)mRNA与蛋白的表达水平(P<0.01)。然而,LPS刺激明显下调了细胞外基质成分、II型胶原蛋白和蛋白聚糖的mRNA与蛋白表达(P<0.01)。4、LPS诱导髓核细胞凋亡Western blot结果显示,与对照组相比,LPS刺激的凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax显著上调;然而,抗凋亡蛋白Bcl-2在LPS刺激的髓核细胞中显著下调(P<0.01)。流式细胞仪检测显示,LPS显著增加髓核细胞的细胞凋亡率,约为对照组的 2 倍(P<0.01)。研究结论1、随着髓核组织退变的加重,miR-486-5p表达呈下降趋势;相反,FOXO1表达呈上调趋势。2、LPS诱导了髓核细胞的退化,表现为增殖抑制、细胞凋亡、细胞外基质合成减少、炎性因子和基质降解酶水平升高。第二部分MiR-486-5p对髓核细胞调控的体外研究研究目的1、通过上调或抑制髓核细胞miR-486-5p的表达,明确miR-486-5p在LPS诱导的髓核细胞中调节细胞凋亡、炎性因子和基质降解酶表达以及细胞外基质合成中的作用机制;2、探究miR-486-5p与FOXO1的靶定与调节关系;明确miR-486-5p与FOXO1在LPS诱导的髓核细胞中相互协同或拮抗作用。研究方法1、采用LipofetaminTM 2000法,在髓核细胞中转染agomir-486-5p或antagomir-486-5p,同时设置各自阴性对照序列转染组,qRT-PCR检测miR-486-5p表达水平;2、CCK-8法检测miR-486-5p表达与髓核细胞增殖之间的关系,AnnexinV/PI法检测细胞凋亡;3、qRT-PCR与Western blot检测FOXO1 mRNA与蛋白,同时分析相关炎性因子、基质降解酶、collagen Ⅱ及aggrecan的mRNA与蛋白表达;4、利用生物信息学、HEK-293T细胞、体外病毒转染、双荧光素酶报告基因试验检测miR-486-5p与FOXO1 mRNA的靶定情况。5、上调髓核细胞中的FOXO1表达,共转染agomir-486-5p或antagomir-486-5p,体外检测髓核细胞的炎性因子、细胞凋亡、基质合成与基质酶表达情况。研究结果1、MiR-486-5p增强了髓核细胞的活力,抑制了 LPS诱导的炎性细胞因子qRT-PCR结果显示,agomir-486-5p可外源性增强髓核细胞miR-486-5p的表达(约3.1倍),而antagomir-486-5p则明显下调了 miR-486-5p的表达(约60%)。相比于对照组,miR-486-5p过表达明显抑制了 LPS诱导的髓核细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA与蛋白表达水平(P<0.001),而antagomir-486-5p则明显增强了 LPS诱导的髓核细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA与蛋白表达(P<0.05)。2、MiR-486-5p促进LPS抑制的髓核细胞的基质生成,抑制LPS诱导的基质降解酶表达髓核细胞经agomir-486-5p、atagomir-486-5p或各自对照序列转染,随后行LPS 刺激。qRT-PCR 与 Western blot 结果显示,agomir-486-5p 组的 collagen Ⅱ 与aggrecan 水平明显高于 agomir-486-5p 对照组,而 antagomir-486-5p 组的 collagenⅡ 与 aggrecan 水平明显低于 antagomir-486-5p 对照组(P<0.001)。此外,miR-486-5p的过表达抑制了 LPS上调的髓核细胞基质降解酶表达(P<0.001),而miR-486-5p的抑制显著促进了 LPS诱导的髓核细胞中基质降解酶的表达,导致基质降解酶的表达水平显著高于LPS单独处理组(P<0.001)。3、miR-486-5p抵抗LPS诱导的细胞凋亡Western blot 结果显示,agomir-486-5p 显著降低了 Bax 和 Caspase-3 mRNA和蛋白的表达;相比之下,agomir-486-5p则明显升高Bcl-2的表达(P<0.001)。相反,antagomir-486-5p明显升高了 Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白的表达,降低了 Bcl-2的表达。流式细胞术结果显示,相比于agomir-486-5p对照组,转染agomir-486-5p的髓核细胞的凋亡率显著降低(P<0.01)。然而,相比于antagomir-486-5p对照组,antagomir-486-5p明显增加了髓核细胞的凋亡率(P<0.01)。4、FOXOl是miR-486-5p的直接靶点生物信息学结果显示,FOXO1的3’-UTR具有与miR-486-5p互补的序列结构。野生型(wild type,WT)或突变(mutation type,MUT)FOXO1 3’-UTR 序列的荧光素酶报告载体转染到HEK-293T细胞后,转染野生型载体的HEK-293T细胞荧光强度明显增高(P<0.05),而转染突变型载体的HEK-293T细胞荧光强度无明显变化(P>0.05)。在miR-486-5p高表达的HEK-293T细胞中,转染全长的FOXO1表达序列后,FOXO1的mRNA和蛋白水平均显著低于空白载体组(P<0.05)。5、FOXO1的过表达或缺乏明显影响了 miR-486-5p对LPS诱导的髓核细胞炎症反应、基质降解和细胞凋亡的抑制作用pcDNA-FOXO1或空白载体对过表达miR-486-5p的髓核细胞共转染后,FOXO1的过表达有效干扰了 miR-486-5p提高的的髓核细胞增殖能力。同时,FOXO1的过表达拮抗了 miR-486-5p过表达诱导的保护效应,反而诱导了炎性因子、基质降解酶的mRNA与蛋白表达,抑制了 aggrecan与collagen II的表达(P<0.001)。此外,在FOXO1与miR-486-5p均过表达的髓核细胞中,相比单纯过表达miR-486-5p的髓核细胞,Bax和Caspase 3的表达量增加约2倍(P<0.001),Bcl-2表达量下降约51.1%(P<0.001)。Annexin/PI检测显示,FOXO1过表达增强LPS诱导的细胞凋亡,部分地影响了 miR-486-5p对凋亡的抑制作用(P<0.01)。研究结论1、miR-486-5p可抑制LPS诱导的髓核细胞炎症反应、基质降解和细胞凋亡;2、FOXO1 的 3’-UTR 是 miR-486-5p 的一个直接靶点;3、miR-486-5p抑制FOXO1表达,参与保护髓核细胞正常的生物功能。第三部分MiR-486-5p对髓核细胞调控的体内研究研究目的基于实验一、二,本组已明确miR-486-5p基因能够直接作用于FOXO1的mRNA3’-UTR靶基因,并经体外研究验证了以上现象。值得注意的是,体外培养细胞的形式通常较简单,能较好的控制培养条件,细胞也很少受到外界因素的影响,因此,单纯的体外研究无法比拟活体的椎间盘真实的组织生长环境。本部分实验中,采用纤维环穿刺法建立SD大鼠的椎间盘退变活体模型,并探究miR-486-5p对髓核细胞炎性反应、凋亡以及基质合成等因子的调控作用。研究方法1、选取 30 只 Sprague-Dawley(SD)大鼠,鼠龄 4 周,体重为(247±22)g,首先选取10只,随机分成假手术对照组与手术组,每组各5只。手术组经腹后外侧入路,暴露L3,4、L4,5、L5,6椎间隙,使用21G穿刺针,将针从由纤维环前外侧平行软骨终板以及脊柱的矢状面以约45°的角度进针,行全层针刺,针刺深度2.3 mm。假手术组仅行腹后外侧切口并缝合。2、在手术组造模的基础上,设置四个转染组,每组各5只,采用注射的方式对椎间盘行agomir-486-5p、antagomir-486-5p或各自对照序列的转染,以上调或下调椎间盘组织内miR-486-5p的表达。3、在术后8周处死大鼠,完整取下各节段包含上下椎体的椎间盘,随后髓核组织将被提取。通过实时定量PCR测定各组的miR-486-5p以及各因子的mRNA表达水平,Western blot测定各因子的蛋白表达。研究结果1、MiR-486-5p抑制大鼠IDD模型的炎症反应与基质降解基因与蛋白的检测结果发现,相比于假手术对照组,手术组的miR-486-5p表达减少,但FOXO1表达增加(P<0.001)。在手术组中,agomir-486-5p转染组的miR-486-5p的表达明显升高,而antagomir-486-5p转染组中的miR-486-5p的表达明显下调(P<0.001)。在炎性方面,炎症细胞因子在agomir-486-5p转染组中表达下调,但在antagomir-486-5p转染组中明显上调。在基质合成方面,agomir-486-5p转染恢复了手术组下调的aggrecan与collagen II的表达,并且抑制了手术组中基质降解酶的表达;然而,antagomir-486-5p手术组表现出相反的结果。2、MiR-486-5p抑制大鼠IDD模型的细胞凋亡Western blot结果显示,相比于假手术对照组,手术组的纤维环穿刺诱导了髓核组织内的细胞凋亡,主要表现为Caspase-3和Bax蛋白表达上调以及Bcl-2蛋白表达下调。在手术组的各个转染亚组中,miR-486-5p过表达部分地抑制了纤维环穿刺诱导的Caspase-3和Bax的蛋白表达,促进了 Bd-2的蛋白表达。相比之下,miR-486-5p低表达部分地增强了纤维环穿刺诱导的Caspase-3和Bax的表达,抑制了 Bcl-2的表达。研究结论MiR-486-5p有可能保护并维持大鼠活体椎间盘组织正常的生物功能,而miR-486-5p下调则加剧大鼠椎间盘的退变过程。