论文部分内容阅读
该论文首先测定了海水小球藻对10种抗生素的敏感性，确定了小球藻基因工程适用的抗生素筛选标记。并以抗生素为除菌工具，获得了无菌的小球藻藻株，优化了无菌小球藻的培养条件。然后以无菌的海水小球藻完整细胞为受体，以gus基因作为报告基因，优化了电击转化条件。在此基础上，将植酸酶基因转入小球藻中，获得了转基因藻株。这不仅为低成本生产植酸酶，使其得以广泛应用，创造更大的经济效益和社会效益打下了基础，同时也为藻类生物反应器的建立及广泛应用开辟了道路。
研究内容及结果：
1、研究了海水小球藻对10种常见抗生素的敏感性及淡化培养对小球藻生长的影响，并测定了潮霉素、G418、氯霉素、Zeocin对小球藻在海水培养基和淡化十倍培养基中的半致死剂量。实验结果表明，小球藻对卡那霉素、庆大霉素、新霉素、氨苄青霉素、头孢霉素、链霉素都不敏感，这几种抗生素在实验范围内不对小球藻的生长产生明显抑制；小球藻对潮霉素较敏感，对G418则很敏感，对氯霉素、Zeocin极敏感。淡化十倍培养对小球藻的生长没有显著影响，且能使小球藻对抗生素的敏感性大为提高。G418适合作为小球藻基因工程的选择试剂，其在固体培养基中的适宜筛选浓度为140.5μg/mL。
2、研究了以抗生素为除菌工具，建立小球藻无菌培养体系的途径。首先测定了小球藻培养液中的细菌对小球藻不敏感的6种抗生素的敏感性，然后研究了适于小球藻除菌的抗生素组合和处理浓度及加入抗生素对小球藻和细菌生长的影响。结果表明小球藻培养体系中的细菌对庆大霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉素和链霉素非常敏感，利用涂平板挑单克隆法去除霉菌后，将这五种抗生素均以终浓度100μg/mL加入小球藻培养体系中，处理两次，获得了无菌的小球藻藻株。进一步研究了接种密度、光强、pH和温度对小球藻生长的影响，并在无菌培养条件下，对影响无菌小球藻生长的五种主要营养因素：NaHCO3、KNO3、KH2PO4、VB1、VB12进行了优化。得到小球藻适宜的培养条件为：初始接种浓度取藻体细胞数为4.27×106个/mL左右；pH范围在10左右；培养温度为25±0.5℃；光照强度约为3.0×103～1.0×1041x。通过五因素四水平正交实验，得到适于无菌小球藻生长的优化培养基配方为：KNO30.5g/L、NaHCO30.2g/L、VB121.0μg/L、KH2PO40.02g/L、VB10.3mg/L。该优化配方加上f/2微量元素后具有明显的生长优势。
3、以无菌的海水小球藻完整细胞为受体，利用CaMV35S启动子作为5上游调控元件，以gus基因作为报告基因，利用电击法将gus基因转入小球藻细胞内进行瞬间表达，研究了电击转化条件、渗透处理、外源DNA浓度、运载DNA浓度和小球藻细胞生长时期对转化效率的影响。结果表明，在5kV的脉冲电压、0.05s的脉冲持续时间、90个脉冲循环和211的脉冲次数下电击可获得较高的转化效率；渗透处理能显著提高转化效率；运载DNA的浓度为150μg/mL、质粒DNA浓度为6μg/mL时转化效率最高；而且处于对数生长早期的小球藻细胞对外源基因有更强的吸纳能力，能获得较高的转化效率。
4、在优化的电击条件下，用构建的含有来源于无花果曲霉A.ficuumAS3.324的植酸酶基因的表达载体pBI121/phyAⅡ与无菌的海水小球藻完整细胞共转化，经G418抗性平板筛选、PCR检测、Southern杂交检测、RT-PCR检测、植酸酶活性检测，确认获得转植酸酶基因的小球藻藻株，且phyAⅡ基因在小球藻细胞中正常转录并得到表达。转基因小球藻的植酸酶性质与无花果曲霉A.ficuumAS3.324的植酸酶性质比较表明，小球藻表达的植酸酶在最适作用温度方面有很大提高，从55℃提高到65℃；在最适作用pH上也有较大变化。两个最适作用pH值分别从pH2.5变为pH3.8，pH5.5变为pH6.0。