本课题前期研究表明全虫蜈蚣提取液(Extract of centipedes, ECP)对肝细胞肝癌(HCC)有一定的治疗作用,并对其治疗肝细胞肝癌的机制作了初步的探讨。我们在此基础上,进一步探讨蜈蚣头足部分、全虫部分、躯干部分提取液对实验性肝癌的抑制作用,并对蜈蚣不同部分提取液(Extract from different parts of Centipedes, ECPs)进行系统的毒理研究,通过观察ECPs的毒理学反应,以期确定ECPs的毒性大小、毒性作用的靶器官,以及探讨ECPs对肝脏毒性作用的机制,为临床合理选择用药提供实验基础。第一章蜈蚣不同部分提取液对肝癌细胞Bel-7404移植瘤的抑制作用目的：研究ECPs在体内对肝癌细胞Bel-7404移植瘤的抑制作用。方法：建立裸鼠Bel-7404人异位肝癌移植模型,以ECPs予以灌服,观察肿瘤生长及肝癌转移情况。结果：①裸鼠Bel-7404人异位肝癌移植模型成功率100%；②ECPs对裸鼠Bel-7404移植瘤有明显抑制作用,移植瘤术后30天,荷瘤对照组肿瘤体积为1000.5+87.4mm3,而头足组、全虫组、躯干组肿瘤体积分别为：460.3+61.7、526.1±75.7、530.7±81.3mm3。移植瘤重量荷瘤对照组为1120.01±101.94mg,而头足组、全虫组、躯干组肿瘤分别为593.73±37.01、659.57+62.88、669.42±45.00mg,对照组与治疗组间均有明显统计学差异(P<0.05),计算头足组、全虫组、躯干组肿瘤抑制率分别达到46.99%、41.11%、40.23%。头足组、全虫组、躯干组组间比较,全虫组与躯干组平均肿瘤重量较为接近,无显著性差异；而头足组平均肿瘤重量低于全虫组与躯干组,有显著性差异(P<0.05)。结论：①成功建立人肝癌Bel-7404细胞株裸鼠移植瘤动物模型；②ECPs以10g生药/kg的剂量给药时,有抑制裸鼠Bel-7404移植瘤的作用,其中头足提取液抑瘤作用更显著。第二章蜈蚣不同部分提取液的毒性研究目的：通过急性毒性试验和长期毒性试验评价ECPs的一般毒性作用；通过体内微核试验、精子畸形试验、Ames试验评价ECPs的遗传毒性作用。方法：(1)急性毒性试验：用不同剂量ECPs灌胃昆明小鼠,观察小鼠活动、毒性反应及死亡情况。(2)长期毒性试验：用不同剂量ECPs灌胃SD大鼠,观察动物的反应及体重变化,分别于第4周和第13周取血作血常规及生化检查及行病理解剖,检查主要脏器的病理变化及计算脏器系数。留下的动物停药后继续观察2周(第15周)后再活杀,了解毒性反应的恢复情况和可能出现的延迟性毒性。(3)遗传毒性试验：①微核试验：用不同剂量ECPs灌胃昆明小鼠。给药后取股骨骨髓细胞制作涂片,观察含有微核的嗜多染红细胞数,以微核率表示。②精子畸变试验：用不同剂量ECPs灌胃昆明小鼠。给药后附睾滤液制作涂片,观察畸形精子数,计算其畸变率。③AMES试验：采用标准平板法,计数每皿上长出的回变菌落数。结果：(1)急性毒性试验：头足组的LD5o为39.18g生药/kg,95%平均可信区间32.89-45.01g生药/kg；全虫组的LD5o为51.20g生药/kg,95%平均可信区间41.81-59.97g生药/kg,躯干组LD5o为53.85g生药/kg,95%平均可信区间45.09-62.12g生药/kg。(2)长期毒性试验：①一般生理指标：实验初期ECPs可引起部分动物呕吐和大便性状改变,随后可缓解。实验过程中,与同期对照组相比,ECPs对SD大鼠摄食量无明显影响；ECPs可引起头足高剂量组大鼠体重增长减慢。②血液学指标：给药期间(第4周,第13周),与同期对照组相比,ECPs可引起RBC、HB降低,ALT、AST增高,BUN、CREA增高,PT、TT、APTT延长,并且有显著性差异(P<0.01,P<0.05)；到恢复期结束,除头足高剂量组ALT、AST外,其它指标基本恢复正常。同时期同处理组不同剂量水平组内比较：高、低剂量之间,以上指标存在统计学差异。同时期同剂量水平不同处理组组间比较：低剂量时,各组间以上指标无统计学差异；高剂量时,头足组与全虫组、头足组与躯干组比较,ALT、AST、BUN、CREA、PT、 APTT存在统计学差异(P<0.01,P<0.05),而全虫组与躯干组比较,无显著性差异(P>0.05)。③病理检查：处死大鼠行病理学检查,各组对脏器系数无明显影响。给药期间,头足中高剂量组、全虫高剂量组、躯干高剂量组可引起肝细胞肿胀改变,头足高剂量组甚至导致肝脏坏死改变,还可引起肾脏轻度水变性改变。停药后2周,肝肾损害程度减轻,肾脏基本恢复正常,部分肝脏遗留坏死改变。各组对心脏、脑、肺脏、脾脏组织无明显损害。(3)遗传毒性试验：①微核试验：蜈蚣提取液各剂量组微核率与阴性对照组之间无显著性差异(P>0.05),而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组间有显著性差异(P<0.01),说明该蜈蚣提取液无致小鼠骨髓嗜多染红细胞微核增生作用。②精子畸形试验：蜈蚣提取液对大鼠精子畸形发生率无明显影响,各剂量组与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05),而阳性对照组与阴性对照组有显著性差异(P<0.01),说明蜈蚣提取液无致小鼠精子畸形作用。③Ames试验：阳性对照组的回变菌落数超过白发回变对照组菌落数的2倍,而蜈蚣提取液各剂量组的回变菌落数均末超过自发回变菌对照组落数的2倍,结果为阴性。结论：①中药蜈蚣头足部分提取液为小毒,全虫部分、躯干部分提取液毒性接近,毒性更小。②相同剂量下,中药蜈蚣不同提取液的毒性大小依次为：头足部分>全虫部分三躯干部分。③ECPs可引起肝肾损害和凝血功能异常,肝脏、肾脏、血液系统可能为主要的毒性靶器官,其中肝脏损害较重,而肾脏和血液系统损害相对较轻。④ECPs在本实验条件下无明显遗传毒性作用。⑤临床治疗肝癌时,以蜈蚣全虫入药为宜,并且可适当加大蜈蚣的用量。第三章蜈蚣不同部分提取液对肝脏毒性损害机制研究目的：通过检测SD大鼠肝脏组织MDA、SOD、CytP450、TNF-α、IL-6水平,探讨ECPs对肝脏毒性损害的机制。方法：硫代巴比妥酸法检测肝组织MDA含量,黄嘌呤氧化酶法检测肝组织SOD活力,CO还原差示光谱法(Omura法)测定肝组织CytP450含量,双抗体夹心ABC-酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肝组织TNF-a、IL-6。结果：与同期对照组相比,ECPs可引起MDA水平增高、SOD活力降低、CytP450含量降低、TNF-α、IL-6含量增高,差异显著(P<0.01,P<0.05)；其中头足高剂量组IL-6、TNF-α的差异到恢复期结束仍然存在(P<0.05)。同时期同处理组不同剂量水平组内比较：高、低剂量之间,以上指标存在统计学差异。同时期同剂量水平不同处理组组间比较：低剂量时,各组间以上指标无统计学差异；高剂量时,头足组与全虫组、头足组与躯干组比较,MDA、SOD、CytP450、TNF-α、IL-6存在统计学差异(P<0.01,P<0.05),而全虫组与躯干组比较,无显著性差异(P>0.05)。结论：①ECPs可引起肝组织MDA水平增高、SOD活力下降,通过脂质过氧化导致肝细胞化学性损伤。②ECPs可引起肝组织TNF、IL-6水平增高,通过诱导细胞因子、炎性因子等对肝细胞产生免疫性损伤。③ECPs可引起肝组织CytP450水平下降,提示中药蜈蚣可能通过影响动物体内组胺—HP450这一途径对肝脏造成损伤。