研究背景和目的氯胺酮(Ketamine),俗称K粉、克他命等,是苯环已哌啶的衍生物。临床上常用的氯胺酮产品的主要成份是盐酸氯胺酮。氯胺酮和其他麻醉药一样,对全身各个器官系统均有作用,而且长期吸食可对神经系统、心血管系统、消化系统、呼吸系统等产生不良影响。但其对泌尿系统的损害,直至2007年才由Shahani等、Chu等首次在全球报道。于同一时期吴芃等在国内首次总结报道了氯胺酮相关性泌尿系统损害(KAUD)的临床病例。随后全球陆续不断有关于滥用氯胺酮导致泌尿系损害的临床报道。我们总结分析当前大多数关于长期滥用氯胺酮导致泌尿系损害的临床病例报道,发现几乎所有患者均有长期滥用氯胺酮的病史,并主要引起下尿路症状(LUTS),如尿频、尿急、尿痛、排尿困难、夜尿增多和血尿等。随着对KAUD认识的提高,早期诊断KC患者中出现肾功能损害的病例也逐渐增多。当前大量临床报道集中于以下尿路损害为主。其中不少报道有部分滥用氯胺酮的患者在影像学、实验室检查等表现有肾积水、双侧或者单侧输尿管积水,肌酐升高、蛋白尿及肾功能不全等上尿路损害的表现。部分患者出现不同程度双侧集合系统扩张和输尿管全程或上段扩张,可伴有肾乳头水肿,膀胱呈小容量挛缩状态,但造成这一损伤的机制,目前仍不清楚。从大量临床报道来看,KC较肾脏、输尿管及胆道等损害出现早且相对具特征性,似乎表明肾损害的结果源于KC的疾病进展,最终导致肾脏不可逆的损害。有学者认为,氯胺酮及其代谢产物可能对膀胱粘膜上皮产生直接毒性作用,继而引起膀胱粘膜下层及平滑肌的炎症反应,导致膀胱挛缩容量减少,输尿管反流,输尿管狭窄或纤维化,最终导致肾积水,进一步导致肾功能不全甚至肾衰竭。但也有报道提到一些患者虽然出现严重肾功能不全却无肾积水表现,而肾穿结果则显示肾小管损害,血管及间质再生,这提示氯胺酮及其代谢产物对上尿路系统的损害可能是直接损害为主,间接损害为辅的一个相互作用的过程。总之,推测氯胺酮及其代谢产物可能对肾脏有损害。虽然众学者提出了较多的发病机制假说,但是氯胺酮及其代谢产物与肾脏结构及功能损害的关系、发病机制等目前仍未清楚。当前较多学者集中于对KC的发病机制进行研究。而关于氯胺酮相关性肾脏损害的研究较少,尤其是缺乏体内验证实验。前期我们课题组在体内、外实验中,研究了氯胺酮及其代谢产物与膀胱损害的相关性及作用机制,并成功建立了氯胺酮相关性膀胱炎的大鼠模型,深入研究了KC发病机制。因此我们在此研究基础之上,进一步对KC大鼠模型的肾脏进行病理学和蛋白质组学等研究,试图阐明氯胺酮及其代谢产物对肾脏结构及功能的影响机制。以期对KC患者可能合并肾损害的早期诊断和治疗提供实验动物上的初步理论依据。方法1.建立氯胺酮相关性大鼠模型及收集尿液、血液。取2个月龄健康、体重为180-200g的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠20只,随机分为4组：空白对照(CON),生理盐水组(NS),低剂量组(LK)(10mg/Kg),高剂量组(HK)(50mg／kg),每组5只,饲养时间为16周。每日上午9时各实验组分别予腹腔注射0.9%生理盐水,10mg/Kg及50mg/Kg氯胺酮。生理盐水组大鼠同时注射等量体积生理盐水,空白对照组不予以任何处理。每周测量一次大鼠体重以调整注射剂量。大鼠单独饲养在自制的代谢笼中,利用自制的尿液染色试纸记录大鼠排尿频率。于第1,4,7,10,13,16周处死前在给大鼠注射药物后,收集大鼠24小时尿液。收集的尿液行尿常规检查。第16周处死时取深静脉血血清行肝、肾功能检查。2.处死后,收集各组大鼠的膀胱和肾脏组织。膀胱用于HE染色、马松染色、免疫组化,观察膀胱粘膜层、粘膜下层及平滑肌层组织学形态,用以确定KC大鼠模型的建立。3.大鼠肾脏洗净后,部分行HE染色,马松染色,TUNEL凋亡检测,用于分析大鼠肾脏形态学上的改变及细胞凋亡情况。液氮冻存部分用于后续的蛋白质组学研究,验证长期滥用氯胺酮可能导致肾脏损害及发生间质纤维化。结果1.大鼠行为学改变及体重变化NS组大鼠在注射生理盐水后,饮水、进食、行为活动等和正常大鼠无明显区别；LK组(10mg/kg)大鼠在注射氯胺酮之后,10分钟内相比CON组和NS组出现轻微兴奋躁动和活动增加的状态,之后约20分钟恢复至正常；HK组(50mg/kg)大鼠在注射氯胺酮后,通常约1分钟即出现全身僵硬症状,疲倦嗜睡,随后10分钟开始出现共济失调,头尾不停摇摆晃动,左右跌倒,接着保持平静不动约1小时直到复原正常活动。我们观察到约12周左右开始HK组和LK组大鼠排尿的频数较NS组和CON组均有明显增多的趋势。大鼠体重变化趋势分析,从第2-6周开始,LK组的平均体重值就随着时间推移较HK组和NS组高；第6周到第16周,NS组和LK组大鼠体重总体趋势均比HK组高.(P<0.001,n=5).2.大鼠尿常规结果在第1周末时HK组1只(1/5)大鼠即开始有尿隐血弱阳性,其余大鼠尿检未见明显异常；第4周末时HK组另外1只大鼠出现尿隐血弱阳性,其余大鼠尿检未见明显异常；第7、10、13周末时,HK组所有大鼠尿常规无隐血阳性；第16周末处死前,我们发现HK组第1周时就出现尿隐血的大鼠再次出现尿隐血阳性。整个过程中,NS组所有大鼠尿常规结果未见明显异常。HK组和NS组所有大鼠在整个过程中的尿常规中均未见到尿白细胞,尿蛋白,且尿葡萄糖、尿胆红素、尿胆原、尿酮体均为阴性。第16周HK组和NS组大鼠尿PH值比较,NS组PH均值(7.00±1.24)；HK组PH均值(7.30±0.76)；两组相比较,无统计学差异(t=-0.452,P=0.663>0.05).第16周时,NS组和HK组大鼠尿比重的比较,NS组尿比重均值(1.005±0.0038)；HK组尿比重均值(1.006±0.0035)；两组比较无显著性差异(t=-0.346,P=0.738>0.05)3.大鼠肝肾功能指标结果。Scr、BUN、TP、ALB、G、ALT、ALP在各组之间比较并无显著性差别。只有UA在HK组和LK均较NS组降低,HK组降低更多。AST在HK和LK组较NS有所降低,但是HK和LK之间无显著差别。虽然各组Scr、BUN均数无差别,但是HK和LK组仍有7只(7/10)大鼠的Scr高于NS组的均值,两组有7只(7/10)大鼠的BUN高于NS组的均值,提示氯胺酮对大鼠肾脏滤过功能有损害作用。氯胺酮处理组几乎所有大鼠(9/10)的UA值都降低,提示经过氯胺酮长期作用的大鼠,可能发生贫血。正常ALT/AST≤1,HK组1只(1/5)大鼠出现ALT/AST≥1,提示滥用高剂量氯胺酮可导致肝炎的发生。4.大鼠膀胱HE染色结果在CON组和NS组中,大鼠膀胱组织在结构形态上未见明显的病理改变。实验组(HK、LK组)大鼠膀胱粘膜上皮层表现为膀胱黏膜上皮层增厚,黏膜下层出现明显水肿,可见大量炎症细胞浸润,部分上皮细胞层全层脱落。HK组的膀胱病理改变较LK组更加明显。各组间膀胱平滑肌未见明显病理学改变。5.大鼠膀胱马松染色结果CON、NS组大鼠膀胱组织未见明显的病理学改变。相比之下,长期注射氯胺酮的HK组及LK组大鼠膀胱黏膜下层和肌层之间均可见纤维组织含量增加和胶原沉积,染色深染,提示膀胱粘膜下层发生纤维化增加。半定量分析发现：CON组平均胶原面积比是(0.31±0.069)；NS组平均胶原面积比是(0.317±±0.073)；LK组平均胶原面积比是(0.639±0.102)；HK组平均胶原面积比是(0.737±0.066).LK组平均胶原面积比,较NS组显著增多(平均差±标准尿频率。于第1,4,7,10,13,16周处死前在给大鼠注射药物后,收集大鼠24小时尿液。收集的尿液行尿常规检查。第16周处死时取深静脉血血清行肝、肾功能检查。2.处死后,收集各组大鼠的膀胱和肾脏组织。膀胱用于HE染色、马松染色、免疫组化,观察膀胱粘膜层、粘膜下层及平滑肌层组织学形态,用以确定KC大鼠模型的建立。3.大鼠肾脏洗净后,部分行HE染色,马松染色,TUNEL凋亡检测,用于分析大鼠肾脏形态学上的改变及细胞凋亡情况。液氮冻存部分用于后续的蛋白质组学研究,验证长期滥用氯胺酮可能导致肾脏损害及发生间质纤维化。结果1.大鼠行为学改变及体重变化NS组大鼠在注射生理盐水后,饮水、进食、行为活动等和正常大鼠无明显区别；LK组(10mg/kg)大鼠在注射氯胺酮之后,10分钟内相比CON组和NS组出现轻微兴奋躁动和活动增加的状态,之后约20分钟恢复至正常；HK组(50mg/kg)大鼠在注射氯胺酮后,通常约1分钟即出现全身僵硬症状,疲倦嗜睡,随后10分钟开始出现共济失调,头尾不停摇摆晃动,左右跌倒,接着保持平静不动约1小时直到复原正常活动。我们观察到约12周左右开始HK组和LK组大鼠排尿的频数较NS组和CON组均有明显增多的趋势。大鼠体重变化趋势分析,从第2-6周开始,LK组的平均体重值就随着时间推移较HK组和NS组高；第6周到第16周,NS组和LK组大鼠体重总体趋势均比HK组高.(P<0.001,n=5).2.大鼠尿常规结果在第1周末时HK组1只(1/5)大鼠即开始有尿隐血弱阳性,其余大鼠尿检未见明显异常；第4周末时HK组另外1只大鼠出现尿隐血弱阳性,其余大鼠尿检未见明显异常；第7、10、13周末时,HK组所有大鼠尿常规无隐血阳性；第16周末处死前,我们发现HK组第1周时就出现尿隐血的大鼠再次出现尿隐血阳性。整个过程中,NS组所有大鼠尿常规结果未见明显异常。HK组和NS组所有大鼠在整个过程中的尿常规中均未见到尿白细胞,尿蛋白,且尿葡萄糖、尿胆红素、尿胆原、尿酮体均为阴性。第16周HK组和NS组大鼠尿PH值比较,NS组PH均值(7.0±1.24)；HK组PH均值(7.30±0.76)；两组相比较,无统计学差异(t=-0.452,P=0.663>0.05).第16周时,NS组和HK组大鼠尿比重的比较,NS组尿比重均值(1.005±0.0038)；HK组尿比重均值(1.006±0.0035)；两组比较无显著性差异(t=-0.346,P=0.738>0.05)3.大鼠肝肾功能指标结果。Scr、BUN、TP、ALB、G、ALT、ALP在各组之间比较并无显著性差别。只有UA在HK组和LK均较NS组降低,HK组降低更多。AST在HK和LK组较NS有所降低,但是HK和LK之间无显著差别。虽然各组Scr、BUN均数无差别,但是HK和LK组仍有7只(7/10)大鼠的Scr高于NS组的均值,两组有7只(7/10)大鼠的BUN高于NS组的均值,提示氯胺酮对大鼠肾脏滤过功能有损害作用。氯胺酮处理组几乎所有大鼠(9/10)的UA值都降低,提示经过氯胺酮长期作用的大鼠,可能发生贫血。正常ALT/AST≤1, HK组1只(1/5)大鼠出现ALT/AST≥1,提示滥用高剂量氯胺酮可导致肝炎的发生。4.大鼠膀胱HE染色结果在CON组和NS组中,大鼠膀胱组织在结构形态上未见明显的病理改变。实验组(HK、LK组)大鼠膀胱粘膜上皮层表现为膀胱黏膜上皮层增厚,黏膜下层出现明显水肿,可见大量炎症细胞浸润,部分上皮细胞层全层脱落。HK组的膀胱病理改变较LK组更加明显。各组间膀胱平滑肌未见明显病理学改变。5.大鼠膀胱马松染色结果CON、NS组大鼠膀胱组织未见明显的病理学改变。相比之下,长期注射氯胺酮的HK组及LK组大鼠膀胱黏膜下层和肌层之间均可见纤维组织含量增加和胶原沉积,染色深染,提示膀胱粘膜下层发生纤维化增加。半定量分析发现：CON组平均胶原面积比是(0.316±0.069)；NS组平均胶原面积比是(0.317±0.073)；LK组平均胶原面积比是(0.63±0.102)；HK组平均胶原面积比是(0.737±0.066).LK组平均胶原面积比,较NS组显著增多(平均差±标准误：0.321±0.050,P=0.0001,P<0.05)；HK组和NS相比较,HK组平均胶原面积比显著高于NS组(平均差±标准误：0.419±0.050,P=0.0001,P<0.05)；HK组和LK组之间无明显差异(平均差±标准误：0.098±0.050,P=0.409,P>0.05).6.大鼠膀胱组织免疫组化各组大鼠膀胱免疫组化显示E-cadherin (E-钙粘蛋白)主要表达于膀胱粘膜上皮层,其他固有层、粘膜下疏松结缔组织层、平滑肌层未见明显表达,血管内皮可见少量表达。对大鼠膀胱粘膜层E-cadherin的表达强度进行量化分析。E-cadherin的平均光密度值,NS组为(0.3656±.0678)；LK组为(0.4380±0.0456)；HK组为(0.5668±0.1972).HK组和NS组的平均光密度值比较,无显著性差异(平均差±标准误：0.2013±0.0933,P=0.204,P>0.05)；LK组和NS组比较,平均光密度值无统计学差异(平均差±标准误：0.0724±0.0365,P=0.221,P>0.05)；HK组和LK组比较也无统计学差异0.1289±0.0905,P=0.475,P>0.05).NS. LK, HK三组间比较无统计学意义(F=3.422,P=0.067,P>0.05)7.大鼠肾脏HE染色结果NS组大鼠的肾脏结构形态均正常,无水肿变形,无淤血或管型。HK组和LK组：肾间质和肾小球周围可见大量炎症细胞浸润；大量肾小管水肿,广泛中重度空泡样改变,多处小灶状小管坏死；肾小球空化,肾小球萎缩,甚至肾小球闭锁,肾小球壁层上皮增生；肾间质有纤维条索形成。8.大鼠肾脏马松染色结果LK组和HK组比较NS组可见肾间质胶原染色深,提示经过氯胺酮长期作用,肾间质发生胶原沉积增加导致纤维化。HK组肾脏间质纤维染色深且可见纤维化条索形成。半定量分析肾间质平均胶原面积比结果显示,三组间比较存在显著性差异(F=29.293,P=0.0001<0.05).NS组肾间质平均胶原面积比是(12.67%±0.0490)；LK组平均胶原面积比是(8.96±0.0209)；HK组平均胶原面积比是(31.53%±0.0682).HK组和NS组比较,有显著性差异(平均差±标准误：0.1886±0.0316,P=0.0001<0.05)。HK组和LK组比较,有统计学差异(平均差±标准误：0.2256±0.0316,P=0.0001<0.05),提示HK组(高剂量)肾间质发生明显纤维化。LK组和NS组比较,无统计学差异(平均差±标准误：-0.0370±0.0316,P=0.793>0.05),提示LK组(低剂量)肾间质胶原沉积和正常肾间质无明显区别。9.大鼠肾脏Tunel凋亡检测结果在肾小球部分。肾小球凋亡细胞数的半定量结果,HK组肾小球平均阳性细胞数是(30.9200±3.21123)；LK组是(40.1600±8.64916)；NS组是(16.6400±4.27411),三组间相互比较具有统计学差异(F=20.372,P=0.0001<0.05).HK组和NS组比较,具有统计学差异(平均差±标准误：14.28000±2.39082,P=0.001<0.05)；HK组和LK组比较,无显著性差异(平均差±标准误：-9.24000±4.12602, P=0.183>0.05); LK组和NS组比较,具有显著性差异(平均差±标准误：23.52000±4.31453, P=0.005<0.05). HK组和LK组凋亡阳性细胞数均比NS组高,LK组阳性凋亡细胞更显著。在皮质区肾小管凋亡细胞计数部分。皮质区肾小管平均每高倍镜阳性细胞数HK组是(103.6000±29.79597),LK组(176.0000±60.12903),NS组(46.4000±28.61468)；三组间相互比较具有统计学差异(F=11.889,P=0.001<0.05).HK组和NS组比较,无统计学差异(平均差±标准误：57.20000±26.63857,P=0.159>0.05)：HK组和LK组比较,无明显差异(平均差±标准误：-72.40000±26.63857, P=0.056>0.05); LK组和NS组比较,具有显著性差异(平均差±标准误：129.60000±26.63857, P=0.001<0.05). LK组皮质区肾小管凋亡细胞数较HK组和NS组都增多。在髓质区肾小管凋亡细胞计数部分。HK组髓质区肾小管平均每高倍镜阳性细胞数是(141.8000±33.15419)；LK组(185.6000±99.57058);NS(62.2000±28.97758)；三组间相互比较具有统计学差异(χ2=7.453,P=0.024<0.05).HK组和NS组比较,有显著性差异(平均差±标准误：79.60000±19.69213,P=0.011<0.05)；HK组和LK组比较,无明显差异(平均差±标准误：-43.80000±46.93293, P=0.738>0.05); LK组和NS组比较,有统计学差异(平均差±标准误：123.40000±39.75458,P=0.027<0.05).LK组髓质区肾小管凋亡细胞数较HK组和NS组都高(平均秩次：LK:10.80>HK:9.60>NS:3.60)扣除肾小球部分后计算每高倍镜视野下平均肾小管阳性细胞数可见,HK组和LK组肾小管阳性凋亡细胞数均多于NS组。LK组肾小管凋亡更加显著。提示长期滥用氯胺酮可诱导肾小管和肾小球细胞凋亡,似乎LK组诱导凋亡更明显。结论通过动物实验研究结果得出,长期滥用氯胺酮的大鼠,会出现体重减轻,尿频,血尿,尿常规异常,肾功能异常,膀胱组织发生炎症和纤维化,肾脏细胞发生凋亡,肾间质纤维化等变化。根据前期课题组的实验条件及本次重复的膀胱结果显示,我们成功建立起KC大鼠模型,我们推测氯胺酮及其代谢产物在肾脏排泄时,直接作用于大鼠肾脏滤过系统,导致了肾脏组织细胞凋亡以及肾功能的变化。可能在氯胺酮滥用患者中,从一开始氯胺酮及其代谢产物就对肾小球滤过系统如足细胞、肾小管上皮细胞等产生毒理作用,导致肾小管,肾间质,肾小球等发生病变。我们发现肾脏间质、肾小球周围等发生炎症细胞浸润,侧面反映了机体免疫系统参与肾损害的修复。推测在早期滥用氯胺酮中这种损害和修复处于动态平衡中,未被打破,因此肾功能并未出现明显变化。这与在临床上早期发生KC的病例大多数出现LUTS症状,膀胱损害明显,而只有少数患者出现肾功能损害基本一致,也就是说当出现KC时,氯胺酮及其代谢产物对肾脏的毒理作用也是正在进行中。至于为什么上尿路发生损害表现较滞后,这可能与氯胺酮及其代谢产物在肾脏滤过滞留时间长短有关。当严重KC患者发生肾积水或者膀胱输尿管返流时出现肾梗阻性损害则进一步加重氯胺酮的作用,最终导致肾功能不全,甚至肾衰竭。因此在临床上,我们对诊断KC的患者早期就应该树立肾脏损害的意识,并对肾脏进行保护。在患者肾功能未出现明显异常时,即应加强补液同时应用利尿剂,促进氯胺酮及其代谢产物快速排出体外,缩短它们在肾脏和整个泌尿道滞留的时间,可减少它们对泌尿系统的损害作用。在已经出现肾功能异常的患者时亦应早期行导尿,抗纤维化等治疗。当然滥用氯胺酮对患者体内多个系统都是有损害的,如肝脏,神经系统,心血管系统等,因此多学科协作、综合及个体化的治疗也是很有必要的。关于氯胺酮对泌尿系损害的机制仍需要进一步研究。