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牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是牛病毒性腹泻-黏膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD/MD)的病原体,可引起牛、鹿、羊等动物发病,表现出广泛的临床体征,包括轻微的上呼吸道征象,循环白细胞的短暂降低和短期低烧,严重呼吸道疾病,胃肠病症,出血综合征和肺炎,繁殖障碍等,给世界各国的畜牧业造成了严重的危害和经济损失。主要研究内容分为以下2部分:1.鹿源BVDV Y2分离株的全基因测序及遗传变异分析以实验室分离的1株鹿源BVDV 1b型Y2分离株为研究对象,进行全基因测序。参照Gen Bank中的BVDV 1b型的全基因组序列的保守区域,设计了8段分段引物。通过Y2病毒增殖,提取病毒RNA,RT-PCR扩增Y2的8个片段,并将各片段分别克隆到p LB simple vector后转化至Top10感受态细胞后进行测序;参考Genbank发表的BVDV 1b型的基因序列对Y2的全基因组进行拼接和分析;对Y2的5’UTR、和全基因、Npro基因、E2基因及编码的氨基酸进行分析和比对,构建遗传进化树。本实验完成了对鹿源BVDV Y2株全基因测序,基因组全长12306bp。其中5’UTR381bp,3’UTR 228bp,CDS区11697bp,能编码3898个氨基酸,Genbank登录号KY964311。Y2囊膜结构蛋白有潜在的N-糖基化位点有11个。根据Y2 5’UTR基因序列构建进化树,Y2株与BVDV-1b型的Osloss、INSP4ncp、GX4株等处于同一个分枝上,为BVDV 1b亚型。通过构建进化树发现:Y2的5’UTR与VEDEVAC、Osloss的亲源距离近,与CP7最远。Y2的全基因及氨基酸与IBSP4ncp、Osloss、GX4和VEDEVAC亲缘距离近,与3156株最远。Y2的Npro基因及氨基酸与Osloss、IBSP4ncp、VEDEVAC、GX4亲缘距离近,Npro基因与JL-1亲缘距离最远,Npro氨基酸AU526、AU526、HP-KY-RK13。Y2的E2基因及氨基酸与Osloss、BSP4ncp、GX4、VEDEVAC近,E2基因与JL-1亲缘距离最远,E2氨基酸与3156株的差异性最大。结果表明Y2株与BSP4ncp、Osloss、VEDEVAC和GX4亲缘关系较近。Y2的全基因测序对BVDV的反向遗传技术的研究、BVDV的持续性感染研究和疾病防控等研究方面有较大的应用前景。2.BVDV分型荧光定量PCR方法的建立实验通过构建BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3标准的阳性质粒和标准阳性RNA,以标准阳性RNA为模板建立一步法实时荧光RT-PCR。建立的3个方法在分别在分别检测猪瘟病毒、小反刍兽疫病毒、BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3、绵羊边界病毒、牛轮状病毒、伪狂犬病毒8种病毒时均无交叉反应,具有良好的特异性。本实验建立分型方法灵敏性好,检测BVDV-1和BVDV-2的检测限最低拷贝数为102copies RNA,检测BVDV-3荧光方法的最低检测拷贝数为103 copies RNA;建立BVDV分型的一步实时RT-PCR在107~105 copies RNA 3个梯度范围内是组内和组间重复性较好(CV<0.02)。并从80个已知样品中检测出了45个BVDV-1阳性感染,5株BVDV-3阳性感染,但未检测出BVDV-2感染的样品。