细胞凋亡是多细胞有机体调节发育的一个重要特征,是指细胞在内、外因子的严格控制下,一种有步骤、有活性的生理性自行消亡的过程。毛囊是一个解剖结构较为复杂的器官,其最显著的特点为周期性再生。在哺乳动物的一生中,毛囊反复周期性地经历生长期、退行期和休止期的过程。Seiberg等人在前人工作的基础上,结合自己的研究结果,提出毛发周期与细胞凋亡有关,认为生长期、静止期和退化期三个阶段均伴有细胞凋亡。本研究利用H·E染色、DNA原位末段标记、透射电子显微镜、免疫组织化学法和荧光实时定量PCR技术,对不同季节绵羊皮肤组织结构、表皮层真皮层厚度、凋亡细胞分布、Bcl-2∕Bax蛋白表达,以及Bcl-2∕Bax mRNA表达的变化规律进行了研究,以期进一步了解毛囊生长周期与细胞凋亡的关系,季节变化与细胞凋亡的关系,以及毛囊中细胞凋亡的规律。研究结果如下:1.不同季节中蒙古绵羊皮肤毛囊形态的变化(1)首先,通过常规H·E染色观察发现,蒙古绵羊的皮肤结构在各季节基本一致,只是皮肤厚度随季节变化而改变。6批样品中,6月份样品的表皮层是一年中最薄的,12月份样品最厚;8月份样品的真皮层是一年中最薄的,10月份样品最厚。通过对各批样品H·E切片表皮层及真皮层厚度平均值的分析发现,蒙古绵羊的皮肤表皮层厚度变化是连续的,而且与季节周期有密切关系。真皮层厚度对季节变化的影响比较敏感。(2)然后,通过原位末端标记TUNEL染色发现,蒙古绵羊皮肤中的凋亡细胞主要存在于毛囊中,毛囊细胞的凋亡在毛囊生长的各个时期都存在,凋亡细胞的数量和凋亡程度因季节而变化。蒙古绵羊皮肤的凋亡指数最高的在6月份,最低的在10月份,呈现一种先升高再降低又升高的倒S型变化趋势。表皮的厚度则与凋亡细胞数呈相反关系,4月份起开始变薄,5~6月份为最薄。这种变化规律与家畜毛被季节性脱换时间相吻合。(3)最后,利用透射电子显微镜技术发现,蒙古绵羊皮肤表皮颗粒层中,细胞凋亡并不常见,不同季节中,其超微结构无明显差异。2.不同季节中蒙古绵羊皮肤毛囊凋亡Bcl-2/Bax蛋白的变化(1)首先,通过免疫组织化学实验发现,绵羊皮肤组织Bcl-2表达阳性细胞率在12月份最高,6月份最低;随着月份的延伸,Bcl-2阳性细胞率数呈现先下降后上升的V型曲线特点。(2)然后,免疫组织化学实验结果表明,绵羊皮肤组织Bax表达阳性细胞率随着月份的更替呈现先增加,在6月份达到最高后又逐渐减少的钟形曲线。Bax表达高峰与Bcl-2表达低谷同时出现在6月份,说明凋亡高峰可能出现在这一时期。(3)最后,绵羊皮肤组织表达阳性细胞率Bcl-2/Bax蛋白表达比值随着月份的延伸,呈现先陡降后缓慢上升的V型曲线特点,4月份最高,6月份最低——凋亡高峰也出现在这一时期。这说明在皮肤的衰退期、生长期和静止期,Bcl-2和Bax的表达呈反比关系,是一对正负凋亡调节基因。前者具有抑制细胞凋亡、延长细胞生存周期、使细胞的积累率增加的功能;后者不仅本身能够诱导细胞凋亡,并且可以与前者一起调控细胞凋亡。3.不同季节中蒙古绵羊皮肤毛囊Bcl-2/Bax mRNA表达的变化(1)首先,通过实时荧光定量PCR发现,Bcl-2 mRNA表达在整个毛囊生长过程中,与免疫组化实验中Bcl-2蛋白表达基本一致,同时与末端标记实验中凋亡细胞在6-8月份增加,10-12月份减少的规律也基本一致。说明Bcl-2 mRN的表达对Bcl-2蛋白表达和细胞凋亡具有显著作用。(2)然后,实时荧光定量PCR结果表明,整个毛囊生长周期中,Bax基因mRNA表达呈波浪状的动态平衡,与免疫组化实验中Bax蛋白的表达基本没有相关性,这表明Bax基因mRNA表达和蛋白水平并不同步。(3)最后,通过对实验数据的分析发现,Bax蛋白的表达与Bcl-2蛋白的表达呈反比关系,这说明细胞凋亡的调控主要通过Bcl-2基因来完成,Bax基因则通过对Bcl-2基因的调节,间接调控细胞的凋亡过程。Bcl-2与Bax之间相互制约、相互影响,从而保持一个相对稳定调控。本研究通过H·E染色、原位末端标记、电镜观察、免疫组织化学,以及实时荧光定量PCR实验等多种检测手段,得到了相一致的结果。研究结果充分表明:细胞凋亡与Bcl-2和Bax的表达有关,Bax基因表达促进细胞凋亡,Bcl-2和Bax的表达在细胞凋亡过程中发挥着重要的调控作用。这为进一步深入研究bcl-2/baX基因在细胞凋亡过程中的可能作用及调控机理,打下了理论基础。对于研究家畜绒毛整个周期中毛囊细胞凋亡与绒毛生长、脱落的关系,Bcl-2/Bax表达和毛囊细胞凋亡的联系,以及揭示羊绒毛生长退化机理,进一步开发人为调控羊绒毛生长与退化技术,具有一定理论价值。