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H5N1亚型流感病毒是高致病性禽流感病毒。它可以感染多种禽类,并且能够由禽类直接传染给人类,对养殖业以及人类的健康构成巨大的威胁。流感病毒自身包含的遗传信息很少,是一种严格的细胞寄生物。其与宿主之间的相互作用构成了病毒感染、复制、致病及免疫的分子基础。由于流感病毒是囊膜病毒,在它的整个感染过程中,病毒与宿主细胞膜融合、内吞以及组装与出芽等进程,都必须依赖宿主细胞膜才能够完成。于是开展对流感病毒感染相关宿主膜蛋白的鉴定这一研究意义重大。因此,本研究以H5N1亚型高致病性禽流感病毒感染前后A549细胞膜蛋白作为研究对象。希望通过膜蛋白质组学的方法,鉴定与H5N1流感病毒感染以及宿主应答密切相关的膜蛋白,并对鉴定到的蛋白做进一步的功能研究,揭示流感病毒的致病机理,此外,还期望可以发现来源于宿主系统的抗病毒药靶或诊断标志物,为病毒病的预防和诊断治疗开辟新的研究方向。主要研究内容如下:1.H5N1流感病毒感染相关宿主膜蛋白的鉴定鉴于膜蛋白在流感病毒感染的过程中发挥着至关重要的作用,本研究以细胞膜蛋白为研究对象,利用双向电泳技术对流感病毒感染以及模拟感染后6、12、24h的A549细胞膜蛋白进行分离寻找出56个差异表达蛋白点,其中20个上调,36个下调。经过MALDI-TOF/TOFMS质谱分析后,成功鉴定到差异表达蛋白42个,其中16个在流感病毒感染后上调,26个在感染后下调。对鉴定到的蛋白进行分析得出,57%的蛋白为膜蛋白或者膜相关蛋白。这些蛋白主要参与细胞骨架的形成;细胞粘附与互作;细胞信号转导;免疫应答;压力应答;转录/RNA加工以及代谢等进程。2.鉴定蛋白对H5N1流感病毒增殖的影响为了研究鉴定到的宿主膜蛋白在H5N1流感病毒感染过程中的生物学意义,我们选取ANXA2、CIQBP、PHB、PRDX1、HSP90AB1和ITGA3六个蛋白展开工作,研究它们对流感病毒增殖的影响。在本研究中,我们通过荧光定量以及western-blot的方法评价出具有良好干扰效率的siRNA。再利用siRNA干扰的方法,将A549细胞中的ANXA2、C1QBP、PHB、PRDX1、HSP90AB1和ITGA3蛋白各自进行特异性表达沉默之后,再感染H5N1流感病毒。结果显示,在这六个蛋白中,有5个蛋白对流感病毒的增殖有影响。其中,C1QBP、ANXA2蛋白沉默后,能够有效的促进H5N1流感病毒的增殖。而PHB、HSP90AB1和PRDX1蛋白干扰掉后,抑制了H5N1流感病毒的增殖。这些蛋白都参与到了一些抗病毒或抗炎症应答途径中。以这些蛋白或者这些蛋白在流感病毒感染中参与的相关的通路为研究对象,有利于揭示新的抗病毒机理。3.ANXA2与流感病毒NS1蛋白的互作本研究通过对H5N1流感病毒感染及模拟感染后24h的A549细胞膜蛋白样品进行BN/SDS-PAGE分离结合MALDI-TOF/TOF MS质谱鉴定的分析,鉴定到可能与流感病毒NS1蛋白存在互作的三个宿主蛋白:β-actin、ANXA1、ANXA2。并用免疫共沉淀以及荧光共聚焦显微镜观察的方法验证了 ANXA2与NS1蛋白的互作。并根据NS1蛋白的结构,进一步将NS1蛋白截短分成RNA结合结构域和效应结构域,分别进行免疫共沉淀,鉴定出与ANXA2互作的是NS1蛋白的效应结构域。本研究成功鉴定到了与流感病毒NS1互作的新的宿主蛋白,为阐明流感病毒感染和致病的分子机制提供了新的方向。