1研究背景肺小动脉的重构是肺高血压发生发展的中心环节,其共同的基本病理改变涉及肺小动脉的外膜、中膜和内膜,包括内皮细胞凋亡和功能紊乱、平滑肌细胞增殖、成纤维细胞活化和迁移、胶原沉积等。近来,全身代谢紊乱和炎症反应在肺血管重构和肺高血压形成中的作用已经被日渐重视。流行病学研究表明,糖尿病作为最常见的代谢异常性疾病之一,与肺高血压的发生显著相关,而且这种相关性独立于冠心病、高血压、慢性心衰、吸烟等因素。代谢紊乱引起肺血管重构的机制比较复杂,包括内皮细胞功能紊乱、平滑肌细胞增殖、成纤维细胞活化和胶原沉积等。单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(Adenosine 5 ’-monophosphate activated protein kinase,AMPK)是能量代谢的关键分子,在糖尿病和其他代谢疾病中起重要作用。近来的研究表明,激活AMPK可以抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖,并且抑制小鼠肺脏和肾脏的成纤维细胞分泌合成胶原,从而缓解器官的纤维化。CIDE(Cell-death-inducing DFF45-like effector)家族是一组能够诱导细胞凋亡的基因,CIDEC(在小鼠称为FSP27)在哺乳动物多种组织中都有表达。近来发现,该基因与肥胖、糖尿病和肝硬化等代谢疾病的发生发展密切相关。CIDE家族可通过对AMPK的抑制发挥其生物学作用:CIDEC可以通过泛素途径与AMPKα1亚基作用,直接降解AMPKα.使总AMPKα水平减少;CIDEC还可以通过抑制AMPK的磷酸化水平降低AMPK的活性。因此,CIDEC表达增加可以抑制AMPK信号通路。基于上述研究我们假设:糖尿病和胰岛素抵抗状态下,CIDEC表达增加,并通过对AMPK信号通路的抑制,从内皮、中膜、外膜等多个方面引起肺血管的重构,而CIDEC基因沉默可以在一定程度上逆转这一病理生理过程。2研究目的我们的研究旨在探讨2型糖尿病对大鼠肺小动脉重构的影响,以及CIDEC/AMPK信号通路在2型糖尿病大鼠肺小动脉重构中的调控作用。3材料与方法3.1动物模型的建立及分组选择5周龄健康雄性SD(Sprague Dawley)大鼠40只,体重120± 20g左右。对所有实验动物行腹腔糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)以及腹腔胰岛素耐量试验(intraperitoneal insulin tolerance test,IPITT)后随机分为2组:空白对照组(Group C)(10只)和2型糖尿病组(30只)。空白对照组大鼠以基础饲料饲养,其饲料的主要成分包括20%粗蛋白,3%粗脂肪,3%粗纤维以及其他74%(包括碳水化合物、微量元素等);2型糖尿病组大鼠以高糖高脂高热量饲料饲养,其饲料的主要成分包括34.5%脂肪,17.5%蛋白质和48%碳水化合物。4周后再次行IPGTT及IPITT,2型糖尿病组大鼠出现胰岛素抵抗者给予一次性腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)27.5mg/kg。空白对照组大鼠给予同等剂量枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。各组大鼠以原饲料继续喂养1周后,测定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和胰岛素(fasting insulin,FINS),计算胰岛素敏感指数[ISI,ISI=In(FINS×FBG)-1]。连续两次空腹血糖≥11.lmmol/L,胰岛素敏感性减低且有多尿、多饮、多食现象的大鼠纳入实验。各组以原饲料继续喂养12周。2型糖尿病大鼠成模后12周,2型糖尿病+重组腺病毒CIDEC基因沉默组大鼠进行CIDEC-siRNA的转染,经颈静脉注射5× 109单位(plaque-forming units)的 CIDEC 重组腺病毒(CIDEC-siRNA),以沉默 CIDEC基因,2型糖尿病+腺病毒空载体组大鼠注射腺病毒空载体作为对照。3.2体重和糖代谢指标的测定所有大鼠均于实验0周、5周、17周和21周末行体重测量。第0周末和第21周末,戊巴比妥钠麻醉大鼠后行心脏左心室穿刺采血,室温静置30分钟后,3000转/分,离心15分钟,取上层血清,采用葡萄糖氧化酶法测定大鼠空腹血糖(FBG)、放射免疫方法检测空腹胰岛素(FINS),并计算胰岛素敏感指数[ISI,ISI=In(FINS×FBG)-1]。3.3 肺动脉前向血流加速时间(pulmonary artery flow acceleration time,PAAT)的测定本研究采用超声心动图测定肺动脉前向血流加速时间(pulmonary artery flow acceleration time,PAAT)的方法评估肺动脉压力。于第21周行超声心动图检查。以脉冲式多普勒超声记录收缩期肺动脉瓣口血流频谱,取肺动脉收缩期血流频谱起点至最高点的时间为肺动脉前向血流加速时间。3.4 右心室肥厚指数(index of right ventricular hyper-trophy,RVHI)的测定超声心动图检查后处死大鼠,打开胸腔,取出大鼠心脏,剪去心房组织,沿心室间隔边缘剪下右心室(RV)及左心室+室间隔(LV+S)并称重;计算右心室肥厚指数RVHI=RV/(LV+S),作为右心室肥厚的指标。3.5肺组织病理学检测肺小动脉重构HE染色主要表现肺小动脉中膜平滑肌增生的情况,肺小动脉的中膜为内外弹力膜之间的部分,平滑肌细胞是中膜的主要成分,因此以平滑肌分布范围估算中膜的面积和厚度。肺小动脉外膜系弹力膜以外的部分,由成纤维细胞和疏松的胶原纤维组成,天狼星红染色主要表现肺小动脉外膜胶原沉积的情况,其中红色、黄色、绿色染色区域代表胶原沉积,用以估算外膜的面积和厚度。显微镜下观察肺小动脉的结构变化,重点观察血管内、中、外层结构变化。每只大鼠的肺组织切片随机选取直径50-200μm的肺小动脉5-10支拍照,以Image-Pro Plus 6.0计算机图像分析软件定量测定肺小动脉的中膜厚度指数(the medial wall thickness index)=中膜厚度/血管壁厚度(HE染色,400倍放大拍照)、中膜面积指数(the medial wall area index)=中膜面积/血管壁面积(HE染色,400倍放大拍照)、外膜厚度指数(the adventitia thickness index)=外膜厚度/血管壁厚度(天狼星红染色,200倍放大拍照)、外膜面积指数(the adventitia area index)=外膜面积/血管壁面积(天狼星红染色,200倍放大拍照)。3.6 PCNA免疫组化检测平滑肌细胞增殖细胞核被染成棕色或棕黄色被定义为阳性结果。PCNA阳性的中膜平滑肌细胞比例定义为细胞增殖指数(the cell proliferation index,PI),用来定量评估中膜平滑肌细胞增殖的情况。各组平滑肌细胞增殖指数(PI)用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件(200倍放大拍照)进行分析和统计。3.7血管壁细胞成分凋亡的检测CIDE蛋白家族是一组能够诱导细胞凋亡的蛋白,因此我们也对各组肺小动脉血管壁细胞成分(主要是内皮细胞(endothelial cells,ECs)和平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs))凋亡的情况进行了评估。我们应用TUNEL法(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling)对组织切片进行凋亡分析。细胞核被染成棕色定义为TUNEL阳性细胞。TUNEL阳性细胞的比例定义为细胞凋亡指数(the cell apoptotic index,AI)。各组细胞凋亡指数(AI)用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件(400倍放大拍照)进行分析和统计。用Western-blotting定量分析肺组织 CIDEC,Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的表达,以评估凋亡情况。应用Image-Pro Plus 6.0计算机图像分析软件定量测定电泳条带的相对光密度,并进行统计分析。3.8免疫印迹(Western-blotting)定量分析信号通路关键蛋白用Western-blotting定量分析肺组织CIDEC,AMPKα和磷酸化AMPKα的表达。应用Image-Pro Plus 6.0计算机图像分析软件定量测定电泳条带的相对光密度,并进行统计分析。3.9统计学方法实验数据用均数±标准误(Mean±SE)表示,使用SPSS Statistics 17.0软件进行统计分析。各组数据进行单因素方差分析(ANOVA),并应用Tukey-Kramer法多重比较检验进行组间差异的统计分析。P<0.05表示比较均值差异有统计学意义。4结果4.1 2型糖尿病组和2型糖尿病+腺病毒空载体组大鼠的体重和胰岛素敏感指数低于空白对照组和2型糖尿病+重组腺病毒CIDEC基因沉默组,空腹血糖和空腹胰岛素水平则明显升高。4.2 2型糖尿病组和2型糖尿病+腺病毒空载体组大鼠肺动脉前向血流加速时间(PAAT)与空白对照组相比均显著缩短,沉默CIDEC基因后PAAT相应延长。各组大鼠的右心室肥厚指数(RVHI)比较均值无显著的统计学差异性。4.3肺组织切片HE染色表明,2型糖尿病组和2型糖尿病+腺病毒空载体组大鼠肺小动脉中膜明显增厚,中膜平滑肌增生,沉默CIDEC基因后肺小动脉中膜重构情况相对减轻。PCNA免疫组化表明,2型糖尿病组和2型糖尿病+腺病毒空载体组中PCNA阳性的肺小动脉平滑肌细胞明显增多,细胞增殖指数(PI)明显升高,沉默CIDEC基因后PCNA阳性的细胞相应减少,细胞增殖指数(PI)相应降低。4.4肺组织切片天狼星红染色表明,2型糖尿病组和2型糖尿病+腺病毒空载体组大鼠肺小动脉外膜明显增厚,胶原沉积增多,沉默CIDEC基因后外膜胶原沉积情况相对减轻。4.5肺组织切片TUNEL法检测肺小动脉内皮细胞和平滑肌细胞的凋亡情况。2型糖尿病组和2型糖尿病+腺病毒空载体组大鼠肺小动脉血管壁可检测到更多的TUNEL阳性细胞,凋亡指数(AIs)明显升高,沉默CIDEC基因后,TUNEL阳性的细胞相应减少,凋亡指数(AIs)相应降低。根据我们的观察,内皮细胞和平滑肌细胞均存在凋亡的情况,而各组间凋亡的区别主要发生于内皮细胞。Western-blotting定量检测肺组织Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP的表达水平。2型糖尿病组和2型糖尿病+腺病毒空载体组大鼠肺组织Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP表达增加,沉默CIDEC基因后,Cleaved Caspase-3和 Cleaved PARP表达相对下调。4.6应用Western-blotting技术分析各组大鼠肺组织中CIDEC、AMPKα和磷酸化AMPKα的表达水平。Western-blotting显示CIDEC在各组大鼠肺组织中均有表达。糖尿病状态下,CIDEC表达增加,对总AMPKα无明显影响,但使AMPKα的磷酸化水平下降,即AMPK的活性降低;而沉默CIDEC基因后,AMPKα的磷酸化水平相应上调。5结论5.1 2型糖尿病和胰岛素抵抗可以引起肺小动脉血管壁的重构和肺动脉压力的升高,尚未引起明显的右心室肥厚;5.2 2型糖尿病和胰岛素抵抗状态下肺组织CIDEC表达增加,使AMPKα的磷酸化水平下降,AMPK的活性降低,引起肺小动脉内皮细胞凋亡、中膜平滑肌增生、外膜胶原沉积增多,肺小动脉中膜、外膜增厚,进一步引起肺血管重构;沉默CIDEC基因可以部分逆转这一病理生理过程;5.3 2型糖尿病肺血管重构是糖尿病血管病变的重要组成部分,CIDEC/AMPK信号通路可能成为治疗2型糖尿病肺血管病变的潜在靶点。1研究目的应用meta分析的方法系统评价代谢综合征及其各组分与肺功能各指标之间的关系。2方法检索PubMed、Embase、Web of Science和CochraneLibrary等英文数据库2017年12月31日之前发表的有关代谢综合征与肺功能关系的文献。根据纳入和排除标准筛选文献,获得病例-对照研究资料,并提取数据。提取数据后采用纽.斯尔-渥太华量农.对文献质量进行评价。结局指标为用力肺活量(FVC)的实测值占预计值百分比,第1秒用力呼气容积(FEV1)实测值占预计值的百分比以及一秒率(FEV1/FVC,FEV1%)。采用StataMP 14.0软件对纳入文献进行临床异质性分析,根据异质性情况选择采用随机效应模型或者固定效应模型合并分析。肺功能指标采用标准化均数差(SMD)及其95%可信区间表示。通过meta回归分析和敏感性分析寻找异质性可能的来源。通过Begg漏斗图和Egger检验来检测纳入研究可能存在的发表偏倚。3结果3.1纳入此篇meta分析关于代谢综合征与FVC关系的研究共有12篇,包括8095例代谢综合征病例以及19498例对照。合并效应量后代谢综合征组与对照组相比差异有统计学意义(SMD=-0.29,95%CI:(-0.38,-0.20),Z=6.24,P<0.001),说明代谢综合征患者FVC减退。3.2纳入此篇meta分析关于代谢综合征与FEV1关系的研究共有12篇,包括8095例代谢综合征病例以及19498例对照。合并效应量后代谢综合征组与对照组相比差异有统计学意义(SMD=-0.22,95%CI:(-0.31,-0.14),Z=5.13,P<0.001),说明代谢综合征患者FEV1减退。3.3纳入此篇meta分析关于代谢综合征与FEV1/FVC关系的研究共有11篇,包括7254例代谢综合征病例以及16170例对照。合并效应量后代谢综合征组与对照组相比差异无统计学意义(SMD=0.05,95%CI:(-0.03,0.13),Z=1.19,P=0.234),说明代谢综合征患者FEV1/FVC与对照组无明显差异。3.4在本篇meta分析中,代谢综合征与FVC的关系、代谢综合征与FEV1的关系以及代谢综合征与FEV1/FVC的关系研究间的异质性均较大,因此我们进行meta回归分析探讨异质性的来源。将舒张压(DBP)和葡萄糖(Glucose)引入回归模型后,研究间方差分量tau2由0.0190分别降至0.007422和0.003123,分别能够解释其60.01%和88.93%的异质性来源,其相应P值分别为0.024和0.034,差异有统计学意义,提示高血压(舒张压)和高血糖与FVC、FEV1的减退有关。3.5我们同样采用meta分析的方法进一步研究高血压与肺功能的关系,合并效应量后结果表明高血压患者FVC和FEV1减退。3.6 Begg漏斗图显示各点间对称性较好,Egger检验示P值均>0.05,说明纳入的研究无明显发表偏倚。4结论我们的研究结果显示,代谢综合征患者FVC和FEV1减退,而FEVi/FVC与对照组比较差异无统计学意义,提示代谢综合征患者存在肺通气功能减退,以限制性通气功能障碍为主。Meta回归分析提示,在代谢综合征各组分中,高血压(舒张压)和高血糖与肺功能的减退相关。