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第一部分Sigma-1受体在急性缺血性脑卒中模型中分布研究目的:Sigma受体主要分为Sigma-1受体和Sigma-2受体两种亚型,在哺乳动物各个系统均有广泛表达,其中Sigma-1受体在中枢神经系统内高表达。研究表明,Sigma-1受体参与众多中枢神经系统疾病的病理生理学进程,如缺血性脑卒中,阿尔茨海默症,帕金森病和精神失常等疾病。本部分探讨小鼠急性缺血性脑卒中模型中Sigma-1受体的分布特点,为开发靶向Sigma-1受体的新型药物提供实验基础。方法:实验选择雄性6-8周龄大小健康C57BL/6J小鼠,光栓法制备永久性大脑中动脉栓塞(permanent middle cerebral artery occlusion,p MCAO)模型模拟急性缺血性脑卒中。造模后24小时,首先应用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered solution,PBS)心脏灌流后,分别留取梗死核心区、梗死周围区及梗死对侧脑组织样本,采用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)方法,检测Sigma-1受体蛋白水平变化。其次应用PBS心脏灌流后加4%多聚甲醛(Paraformaldehyde,PFA)灌流固定,留取小鼠脑组织样本,采用免疫组化染色和免疫荧光染色方法,观察Sigma-1受体在脑内的分布特点。此外,小鼠造模后按时间顺序采集T2WI序列、DWI序列和PWI序列图像信息,划分缺血半暗带区域。并留取相应脑组织切片,采用免疫荧光染色方法,观察Sigma-1受体在造模后的分布特点,另观察其分布范围与缺血半暗带的关系。结果:在小鼠造模后24小时小鼠脑内Sigma-1受体在梗死周围区较梗死对侧区域和梗死核心区表达显著升高。缺血半暗带出现在造模后1h的梗死周围区,Sigma-1受体表达升区域与缺血半暗带范围一致。结论:Sigma-1受体在急性缺血性脑卒中造模后小鼠缺血半暗带区域表达显著升高,可以靶向缺血半暗带区域表达升高的Sigma-1受体,开发治疗治疗急性缺血性脑卒中的新型药物。第二部分新型Sigma-1受体激动剂对急性缺血性脑卒中模型的神经保护作用研究目的:在前期工作基础上,本课题组和中国药科大学合作,自主合成一系列Sigma-1受体激动剂。本部分旨在探讨验证自主合成的新型Sigma-1受体激动剂在小鼠急性缺血性脑卒中模型中的神经保护作用,并对其作用机制进行初步探究。方法:实验选择雄性6-8周龄大小健康C57BL/6J小鼠,应用线栓法制备短暂性大脑中动脉栓塞(transient middle cerebral artery occlusion,t MCAO)模型模拟急性缺血性脑卒中,用激光多普勒血流仪(Laser doppler flow imager)评判模型成功与否。造模成功后立刻按照实验分组给予不同剂量(0.15 mg/kg,0.5 mg/kg和1.5 mg/kg)的化合物M4,和剂量为0.2 mg/kg的阳性参照物SA4503(Sigma-1受体激动剂),造模24小时后分别先后应用核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)和2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法测量脑梗死体积,并应用软件Image J进行量化统计,计算脑梗死体积百分比。运用改良型神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,m Nss)测定神经功能损伤水平;应用Western Blot方法检测缺血核心区星形胶质细胞标志蛋白(GFAP)、凋亡相关蛋白(Bax,Bcl-xl,Caspase-3,Cleaved Caspase-3)及自噬蛋白(LC3B-II)的表达变化;在离体水平上采用氧糖剥夺/再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R,条件为氧糖剥夺3小时,再灌注6小时的)模型处理原代星形胶质细胞(Primary astrocyte)及人星形胶质细胞株-A172,应用噻唑蓝(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-Htetrazoliumbromide,MTT)法检测星形胶质细胞活力,应用Western Blot方法检测GFAP、Bax、Bcl-xl、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、C3B-II的蛋白水平变化。小鼠造模前三天进行行为学训练(网格实验和圆筒实验),剔除行为过度活跃或迟钝的异常小鼠,采用光诱导方法构建小鼠p MCAO模型,分别于造模后2、7、14、28及56天进行行为学实验,并留取56天小鼠脑组织样本,应用Westernblot方法,检测突触后密度蛋白95(Post-Synaptic Density protein 95,PSD-95)和突触前蛋白(Synapsin)的表达变化。结果:MTT结果表明化合物M4可以逆转OGD/R模型下小鼠原代星形胶质细胞和星形胶质细胞株A172细胞活力下降。MRI和TTC染色结果M4可以降低小鼠急性缺血性脑卒中模型的脑梗死体积百分比、减轻神经功能缺损评分。Western blot结果表明M4抑制星形胶质细胞活化,抑制缺血侧细胞凋亡和自噬。长时程给予化合物M4可以改善小鼠的感觉运动功能缺损评分,提高突触相关蛋白表达水平。结论:本研究发现自主合成的Sigma-1受体激动剂M4可以通过抑制星形胶质细胞活化,抑制细胞凋亡和细胞自噬,从而降低缺血性脑卒中模型后脑梗死体积,降低神经功能缺损评分;长期应用Sigma-1受体激动剂M4可以提搞小鼠卒中后神经可塑性、改善感觉运动功能损伤。因此,自主合成的新型Sigma-1受体激动剂M4具有治疗急性缺血性脑卒中的潜能。