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研究背景及目的多囊肾病(polycystic kidney disease,PKD)是一组常见的遗传性肾病,其主要病理改变是双侧肾脏的肾小管上皮细胞形成进行性扩张的液性囊泡,进而压迫正常的肾组织,导致肾功能衰竭,严重影响患者的生活与生存。根据致病基因以及疾病特征的差异,多囊肾病主要分为常染色体显性多囊肾病(ADPKD)及常染色体隐性多囊肾病(ARPKD)。虽然已有越来越多的PKD致病基因和可能的发病机制被报道,但至今尚无有效的治疗手段,临床上普遍采取的仅是对症处理。依据发病机制转化临床治疗策略已经成为迫切需求。越来越多的证据表明,基因突变而导致纤毛结构或者功能的缺陷会出现多囊肾病的表型,而“纤毛致病假说”成为PKD的研究热点之一。学者发现多种ADPKD和ARPKD致病基因编码的蛋白质分布于肾管上皮细胞的初级纤毛上,可能参与感受管腔内的液流机械刺激,进而介导细胞内信号转导。Hippo通路在果蝇及哺乳动物中均高度保守,是调控器官组织大小的重要信号通路,通路异常与多种肿瘤的发生密切相关。近年来研究提示Hippo通路异常,特别是其靶因子Yap表达水平改变,与肾脏异常发育及多囊肾病的发生密切相关。本科室前期研究亦表明,在Han:SPRD杂合子和ADPKD患者肾组织中存在异常高表达及核转位。然而Yap在正常生理状态下,是否以及如何参与肾脏发育,及对多囊肾病发生和进展的影响机制尚有待于探索。因此,我们以模式生物斑马鱼为模型,通过morpholino注射技术下调yap表达,观察到其对斑马鱼前肾囊肿形成,肾管发育形态,群体细胞迁移,纤毛发生的重要作用,并发现在多囊肾斑马鱼模型pkd2morphants(morpholino注射胚胎)过表达yap能够挽救疾病表型。本研究首次阐述了Yap在体内与纤毛发生及囊肿形成的相关性,以及抑制多囊肾进展的保护性作用,为多囊肾病治疗提供了新的靶点和契机。实验方法一、检测斑马鱼胚胎发育中yap的表达定位应用primer premier5.0软件,设计针对斑马鱼Yap基因的上下游引物并合成,通过基因克隆技术构建p CS2-yap,p Tol2-8kb-EGFP-yap质粒,T7转录获得yap反义m RNA探针。收集不同发育阶段的斑马鱼胚胎,通过原位杂交技术,观察yap m RNA在不同发育时期的表达谱,重点关注其在肾管及纤毛相关的器官的分布。收集受精后1天(1 day postfertilization,1 d.p.f)和2天斑马鱼胚胎,Dents液(80%甲醇,20%二甲基亚砜)固定后,进行免疫荧光染色,检测Yap蛋白的细胞亚定位;在一细胞期斑马鱼胚胎细胞内注射p Tol2-8kb-EGFP-yap质粒和转座酶m RNA,收集在肾管有特异性绿色荧光的胚胎,检测Yap蛋白的细胞亚定位。二、斑马鱼胚胎反义吗啉环寡核苷酸(morpholino,MO)注射下调Yap表达MO技术目前已广泛运用于生物发育中基因功能研究。其序列通过碱基互补能与特定的m RNA结合形成双链物有效阻止基因的转录。本研究根据已有文献报道,合成获得特异性结合yap 5’端非翻译区(untranslated region,UTR)的MO序列,注射到一细胞期斑马鱼胚胎卵黄中获得yap morphant,并通过免疫印迹(western blotting)检测Yap蛋白表达变化及表型挽救实验明确yap 5’UTR MO的有效性和特异性。三、观察yap对斑马鱼肾管发育,细胞迁移,细胞极性,纤毛生成的影响观察yap morphant不同胚胎发育时期大体表型改变;通过转基因鱼Tg(Na+/K+ATPase:EGFP)观察yap morphant前肾发育的改变;原位杂交检测yap morphant前肾肾管不同节段标记探针的表达差异,了解肾管群体细胞迁移的改变;免疫荧光检测yap morphant肾管顶底端细胞极性的改变;免疫荧光检测yap morphant纤毛形态的变化,以及在纤毛发生过过程中基体向顶端膜迁移过程的改变;显微共注射观察Yap与纤毛相关基因对斑马鱼前肾囊肿形成的协同效应。四、观察斑马鱼中Yap与多囊蛋白2(polycystin-2,PC-2)之间的相互关系通过显微共注射观察在斑马鱼胚胎发育中yap与ADPKD致病基因pkd2在前肾囊肿形成过程中存在基因互作效应;而在pkd2 morphants中过表达全长yap m RNA和磷酸化位点突变的yapS127A m RNA,观察对前肾囊肿形成比例的影响。五、统计学处理所有结果以x±s表示,数据采用Graphpad Prism 5.0软件进行统计学分析及制图。方差齐性采用非配对t检验,方差非齐性则采用秩和检验。多组间分析采用one way ANOVA。P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异非常显著。【实验结果】一、yap在斑马鱼胚胎发育中的基因研究原位杂交显示,在斑马鱼胚胎发育中yap是母源表达基因,合子基因表达从中囊胚过度时期(mid-blastula transition,MBT)开始,在6体节(somite)时期可见于侧板中胚层(lateral plate mesoderm,LPM)和中间中胚层(intermediate mesoderm,IM),从19s,24 hpf,48hpf,72hpf均可见在前肾肾管中有表达,此外在多个纤毛相关器官,如眼,耳,脑中也有分布。运用Yap抗体进行免疫荧光显示内源性Yap蛋白亦明显分布斑马鱼肾管,其细胞亚定位为在肾管上皮细胞顶端膜及胞浆聚积;而在肾管特异性过表达EGFP-Yap融合蛋白,显示的细胞亚定位与内源性蛋白免疫荧光结果一致。二、yap对斑马鱼肾管发育,细胞迁移,细胞极性的影响yap morphants在胚胎发育过程中出现心包水肿,脑水肿,前肾囊肿,体轴轻微弯曲,小眼,短体等表型,且这些表型能够通过同时过表达全长的yap m RNA获得一定程度的挽救,前肾囊肿比例显著下降(P<0.05),而过表达磷酸化位点突变的yapS127A m RNA,前肾囊肿比例改变没有统计学意义;转基因斑马鱼Tg(Na+/K+ATPase:EGFP)的肾管带绿色荧光可观察发育各阶段的变化,发现yap morphants在24 hpf在肾管泄殖腔可见闭合异常及膨大扩张,其比例约15%,从48 hpf开始可见6.7%的肾管出现中断,其比例随时间推移明显增加,至72 hpf可达到26%,分别通过cldh17探针原位杂交和α-6F抗体免疫荧光观测72 hpf胚胎前肾肾管全长,均可见同转基因鱼显示的肾管中断现象,而泄殖腔发育异常的比例并没有明显改变,此外肾管总体长度变短,前端的弯曲消失,提示肾管群体细胞迁移的异常;24 hpf胚胎PCNA抗体免疫荧光显示肾管远端细胞增殖无明显异常;分别通过斑马鱼前肾肾管节段特异性的标记探针进行原位杂交观测肾管群体细胞迁移过程中的改变,可见在24 hpf胚胎wt1b,slc4a4a+,trpm-7,slc12a1,slc12a3,evx1的表达均没有明显改变,说明细胞命运并没有改变;而观测72 hpf胚胎肾管特异性标记物,可见wt1b标记的肾小球形成囊肿样扩张,slc4a4a+标记的肾管前端“发夹”样弯曲消失,迁移明显滞后,且在slc4a4a+,trpm-7+和slc12a1+细胞节段可见肾管中断,泄殖腔标记探针evx1表达下调甚至消失;免疫荧光显示yap morphants顶底端膜细胞极性存在异常,顶端膜标记蛋白a PKC分布无明显异常,而侧基底膜标记蛋白α-6F在基底膜分布减少,并在顶端膜也存在定位。三、yap对斑马鱼纤毛发生的影响yap morphants存在多种类“纤毛病”表型,而眼及肾管的纤毛形态存在缺陷:眼部外层纤毛明显变短甚至缺失;肾管中段多纤毛区明显变少,或被单纤毛取代,而后段单纤毛数量(20.3±1.5 vs对照组30.3±2.7;P<0.01)和长度(3.9±0.2mm vs对照组6.2±0.2mm;P<0.001)显著变短;肾管多纤毛基体非正常的线性排列,而变为团状簇拥,这可能是影响多纤毛束形成的原因;多纤毛和单纤毛基体在扩张的肾管中亦存在未完全迁移至顶端膜,影响纤毛的发生。原位杂交检测纤毛必须基因foxj1a,发现在24 hpf和72 hpf的yap morphants胚胎表达均上调,因在野生型及yap morphants中过表达foxj1a m RNA并未肾管对纤毛结构有明显影响,考虑yap morphants胚胎中foxj1a表达是反馈性上调。而检测多纤毛标记探针shippo1发现在72 hpf yap morphants胚胎存在分布的异常。此外,显微共注射实验证实斑马鱼中yap分别与纤毛蛋白运输相关基因ift20,ift88和arl13b在前肾囊肿形成的通路上存在协同互作效应。四、Yap与多囊蛋白2(polycystin-2,PC-2)的基因互作效应,以及过表达Yap对pkd2 morphants前肾囊肿生成的保护性作用在斑马鱼胚胎发育中yap与ADPKD致病基因pkd2在前肾囊肿形成过程中存在基因互作效应,在低浓度yap MO和pkd2 MO共注射胚胎产生前肾囊肿的比例远大于单独MO注射比例,差异具有显著统计学差异(P<0.01)。在pkd2 morphants中过表达全长yap m RNA能够显著降低其前肾囊肿形成的比例(P<0.05),但是在pkd2 morphants中过表达磷酸化位点突变的yapS127A m RNA没有表型挽救效果。结论1.在斑马鱼胚胎发育中yap m RNA在前肾肾管中有持续表达,而Yap蛋白在肾管上皮细胞顶端膜及胞浆聚积。2.在斑马鱼胚胎下调yap表达会出现心包水肿,脑水肿,前肾囊肿,体轴轻微弯曲,小眼,短体等类似“纤毛病”的表型。3.yap morphants前肾肾管各个节段的细胞群体迁移存在缺陷。4.yap morphants前肾肾管的侧基底膜细胞极性存在异常,向顶端膜分布。5.yap morphants眼及肾管的纤毛形态存在缺陷,肾管多纤毛基体的排列和单纤毛基体的顶端膜迁移异常。6.yap分别与纤毛蛋白运输相关基因ift20,ift88和arl13b在前肾囊肿形成的通路上存在协同互作效应。7.斑马鱼中Yap与PC-2在肾囊肿形成通路中具有基因互作效应,过表达可磷酸化Yap能够部分挽救pkd2缺失导致的肾囊肿形成。