论文部分内容阅读
痴呆是由于脑功能障碍而产生的获得性和持续性智能障碍综合征。其中，血管性痴呆(vascular dementia，VD)是因脑血管疾病所致的一种慢性阶梯性进展的疾病。明显的、进行性的学习记忆能力的损害是痴呆患者的主要临床症状，至今对其仍无有效的防治措施。 内源性阿片系统通过阿片受体的介导在人类及动物的学习记忆等智能活动中发挥着重要的作用。Alzheimer病患者脑内的阿片系统发生了明显改变，提示内源性阿片和阿片受体系统可能参与了痴呆的智能障碍。阿片受体拮抗剂纳洛酮可以阻断内源性阿片肽对学习记忆的损害并对部分Alzheimer病患者的记忆障碍有改善作用。但纳洛酮对血管性痴呆的学习记忆减退的影响目前尚未见报道。 海马是大脑的一个重要结构，在学习记忆活动中起着重要作用。海马又是极易受损并极具可塑性的脑区。海马神经细胞的数量减少和功能障碍，是痴呆所致的智能缺陷的病理基础之一。 因此本实验以血管性痴呆大鼠为模型，观察了纳洛酮对其空间学习记忆能力的影响，并在此基础上观察纳洛酮对海马锥体细胞结构和细胞凋亡的影响，结合离体海马脑片电生理实验检测纳洛酮对海马神经元突触可塑性的影响，研究纳洛酮对海马锥体细胞内核酸代谢的影响。结果证实了纳洛酮能够从减少血管性痴呆大鼠海马CA1区细胞的凋亡、调节锥体细胞内核酸代谢和提高海马神经元突触可塑性等方面改善了血管性痴呆的学习记忆障碍。汕头大学医学院博士学位论文材料与方法一、实验材料1.实验动物 16个月清洁级雄性SD大鼠21只，体重352.1士23.59。2.实验药品 盐酸纳洛酮注射液困aloxone Hydroehloride Injeetion)，商品名:金尔伦，Tofuidine BlueO，饿酸，醋酸双氧铀，叮陡橙，内皮素放免试剂盒。3.实验仪器 手动脑薄片切片刀(美国Teyler实验室);PD一5微电极拉制器(日本成贸);sEN一7203三路电子刺激器(日本光电);MEN一8301微电极放大器(日本光电);55一20lJ隔离器(日本光电);VC一H记忆示波器(日本成贸);日立H30O型透射电镜，ACAS Ultima一312型激光扫描共聚焦显微镜系统(Meridian Inc.美国);SN一682型Y一闪烁计数仪(上海原子核研究所)。二、实验方法1.动物模型建立和分组 采用双侧颈总动脉永久结扎方法制备血管性痴呆大鼠。大鼠随机分为三组:假手术对照组，血管性痴呆组，血管性痴呆纳洛酮治疗组(每天0.8mg瓜g纳络酮腹腔注射，连续7天)。每组均为7只大鼠。2.Mo币s水迷宫(Morris water maze，MWM)成绩测试 包括Mo雨s水迷宫定位航行实验、可见平台实验和空间探索实验，观察纳洛酮对血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力的影响。3.海马HE和Nissl染色 将大鼠左侧脑组织置于4%中性福尔马林溶液中固定24小时，常规石蜡包埋。每只动物在矢状缝外Inlnl处连续切片，等间隔取两张4微米和四张厚6微米的矢状面切片，分别行常规HE染色和Nissl染色。4.血浆内皮素水平测定 采用非平衡放射免疫法。5.海马CAI区超微结构的观察 游离海马，迅速置于2%预冷的戊二醛溶液中固定。将海马CAI区切汕头大学医学院博士学位论文成微小组织块，饿酸固定，脱水，树脂包埋，醋酸双氧铀染色，透射电子显微镜观察。6.海马CAI区细胞凋亡的观察 TUNEL法和流式细胞仪检测海马CAI区细胞凋亡。7.海马脑片Schaffer侧枝至CAI通路长时程增强(L ongT’e nn Potentiation， LTP)的检测 刺激电极置于海马CA3区的Schaffer侧枝处，记录电极放置于CAI区锥体细胞处以记录ps。强直刺激(pulse 50，burst3，main interval 1205)后观察PS相对于基线的变化。8.海马锥体细胞DNAJRNA的检测 激光共聚焦显微镜观察海马神经细胞内DNA和RNA的荧光强度，并用图像分析技术进行处理。三、数据分析 所有数据以平均值士标准差(Mean士SD)表示，运用SPSS 10.0软件包进行处理。统计学方法采用双因素重复测量方差分析(two一way rePeatedmeasures ANOVA)和one一w盯ANoVA。六0.05表示有统计学差异。实验结果一、纳洛酮对血管性痴呆大鼠MWM成绩的影响 1.隐匿平台潜伏期 双因素重复测量方差分析显示纳洛酮对三组大鼠的隐匿平台逃避潜伏期有显著的影响沪<0.001)。痴呆组大鼠的逃避潜伏期与假手术组和纳洛酮组相比分别明显延长(六0.05)，而纳洛酮组大鼠的逃避潜伏期与假手术组大鼠的比较无显著差异(外0.05)。 2.空间探索实验 痴呆组大鼠穿越原隐匿平台位置的探索次数最少(4 .64士1 .73次/m in)。纳洛酮组大鼠的平均探索次数(8.36士1 .38次/m in)比痴呆大鼠显著提高(P<0.001)，但仍然低于假手术组(8.36土1 .38次俪n，P<0.ol)。 3.可见平台实验 假手术组、纳洛酮组和痴呆组动物的可见平台逃避潜伏期未见明显差汕头大学医学院博士学位论文异(P>0.OS)。二、纳洛酮对血管性痴呆大鼠血浆内皮素(endothelin，ET)水平的影响 痴呆组大鼠血浆ET水平(134.”士20.76pg闹)比假手术组(74.83士14.74 pg闹)显著升高沪<0.01)，纳洛酮