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牛支原体(Mycoplasma bovis)是一种无细胞壁的原核生物,常存在于牛的呼吸道和生殖道,当牛只长途运输,或免疫力低下时容易被感染,引起严重肺炎、乳腺炎,还可导致关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产或不孕等多种疾病。牛支原体病在世界范围内存在,严重损害了养牛业的经济利益：欧洲每年因牛支原体引起的犊牛肺炎经济损失为1.44-1.92亿欧元；近年在我国湖北、贵州、宁夏、内蒙古、广西、重庆等省、自治区的牛群中也流行该病。目前国内外缺乏安全有效的牛支原体疫苗,是造成该病多处流行的原因之一为了确诊重庆某肉牛场爆发的呼吸系统疾病,本研究通过病原分离培养、16S rRNA序列测定和牛支原体特异性基因扩增,确定分离株为牛支原体。为了筛选一个适用于牛支原体疫苗生产的抗原蛋白,采用生物信息学软件分析了牛支原体GAPDH基因的免疫学信息,筛选了抗原指数较高的片段进行克隆表达。通过动物试验、Western-blot试验和间接ELISA试验分析了重组蛋白的生物学活性,为牛支原体基因工程疫苗的研制提供了参考依据。本试验内容包括以下几个方面：1牛支原体分离株的PCR鉴定扑杀具有肺炎临床症状的病牛,无菌采集肺脏组织,采用实验室病原分离技术进行病原分离纯化。在5%CO2培养箱37℃条件下培养的马丁氏培养基中,分离到一小菌落,40倍显微镜下观察菌落呈“煎蛋样”,命名为CQ1。设计合成支原体16S rRNA通用引物和牛支原体oppD/F基因特异性引物,利用PCR方法鉴定分离株。结果表明,该分离株16S rRNA序列与牛支原体PG45株(登录号：AF332756)相似性为99.9%,与无乳支原体(登录号：AY526879)相似性为99.3%。利用牛支原体oppD/F基因特异性引物,扩增出了1900bp的目的片段,经测序比对,与牛支原体oppD/F基因序列重复率为100%。通过药物敏感性试验和动物试验,初步探索了分离株的药物敏感性和毒力。该分离株对环丙沙星、氧氟沙星、四环素、壮观霉素敏感性较高。经胸腔和滴鼻攻毒BABL/c小鼠、昆明小鼠、新西兰大白兔、Z:ZCLA长爪(?)鼠,不致死试验动物。2牛支原体GAPDH基因片段的克隆表达以牛支原体PG45株的GAPDH基因序列为模板,分析其免疫学信息,筛选抗原指数较高的280～921bp序列为目的片段进行克隆表达。利用SDS-PAGE检测重组蛋白表达形式和表达量。重组质粒pET-32a(+)/GAPDH在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中以可溶性蛋白形式高效表达。3重组蛋白的免疫活性分析将分离株全菌蛋白制成油乳剂疫苗免疫家兔,通过琼脂扩散试验检测多克隆抗体制备效果。多克隆抗体与全菌蛋白形成沉淀线的最高稀释比为1：32,多克隆抗体能与纯化后的重组蛋白形成单一沉淀线。利用Western_blOt试验验证了重组蛋白与多克隆抗体能特异性结合,具有较强的反应原性。将重组蛋白作为包被抗原尝试构建间接ELISA鉴别诊断方法,结果表明该方法不能准确区分阴阳性血清,特异性不高。综上所述,本次研究分离到了一株牛支原体,为后续试验提供了实验材料；该分离株GAPDH基因的280～921bp序列片段在大肠杆菌表达系统中能以可溶性蛋白形式成功表达,便于重组蛋白的分离纯化；多克隆抗体琼脂扩散试验、Westem-blot试验和间接ELISA试验结果表明,重组蛋白有较好的免疫原性和反应原性,为进一步研制基因工程疫苗提供实验依据,但不适用于诊断方法的构建。