高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）作为小麦籽粒贮藏蛋白的重要组分,其质量和数量能直接影响到小麦面粉的加工品质。野生二粒小麦（Triticum turgitum ssp.dicoccoides,AABB,2n=4x=28）作为普通小麦的二级基因源,拥有丰富的HMW-GS等位变异。对其特异HMW-GS基因的鉴定和利用既能丰富普通小麦中HMW-GS基因的遗传多样性,又能为普通小麦品质改良提供有利的基因资源。针对普通小麦高分子量谷蛋白亚基的Glu-A1和Glu-B1位点中,1Ax和1By常不表达,1Ay基本不表达的问题,在我们前期对野生二粒小麦Glu-B1位点的沉默型1Bx和表达型1By基因,以及Glu-A1位点的1Ax基因进行分子鉴定的基础上,本研究进一步对野生二粒小麦Glu-A1位点的1Ay基因进行挖掘和利用价值研究。在对野生二粒小麦1Ay基因进行分子鉴定的基础上,用携带活性y-型HMW-GS基因的野生二粒小麦D97作父本与高产弱筋小麦品种川农16（CN16）作母本进行远缘杂交,得到异源五倍体F₁（AABBD）,并通过连续多年套袋自交并逐年选育获得了一个农艺和产量性状理想的杂种高代稳定的六倍体普通小麦品系TaAy7-40,并分析后代的y-型HMW-GS基因1Ay和1By的传递、表达特性及其对普通小麦品质的遗传改良潜能。在此基础上,借助创制的携带野生二粒小麦活性1Ay基因的普通小麦基因资源,进一步探讨在普通小麦背景下的外源活性1Ay基因在普通小麦间的传递与表达特性,及其对普通小麦Glu-A1位点的丰富性能和对品质改良的利用价值。主要研究结果如下:1.本研究对野生二粒小麦D97的1Ay基因进行了克隆和原核表达,分析了该基因的结构特征以及与其它已知1Ay基因的系统进化关系,确定了该基因为一个活性1Ay基因。随后,通过SDS-PAGE分析发现,TaAy7-40品系中含有包括1Ay亚基在内的所有6条HMW-GS条带。继而对该品系以及亲本中的1Ay基因进行分子鉴定。分子克隆和序列分析显示,父本D97和后代TaAy7-40的1Ay基因的开放阅读框（ORF）长度均为1,830bp,编码608个氨基酸残基,两条序列相似度达99.2%。其编码功能也通过原核表达系统进一步确认。母本CN16的1Ay基因的ORF只有1791bp,并在其1000-1002位置存在一个提前终止密码子（TGA）,表明该基因是一个不表达蛋白的假基因。进一步对三条核苷酸序列比对发现,TaAy7-40与D97相比存在14个单核苷酸多态性（SNP）,包括13个转换和1个颠换。而在TaAy7-40和CN16之间鉴定了30个SNPs,包括25个转换和5个颠换。通过对推导的氨基酸一级结构进行分析,结果表明,与父本D97和后代TaAy7-40相比,普通小麦母本CN16中出现三处缺失和一个提前终止密码子。通过与GenBank数据库中已有的1Ay等位基因序列进行比较分析发现,TaAy7-40的1Ay基因和父本D97的紧密聚为一支,而与母本CN16的1Ay核苷酸序列距离疏远。显然,TaAy7-40的活性1Ay基因应该是来源于父本D97的。由此可见,野生二粒小麦的活性1Ay基因通过远缘杂交成功地导入到普通小麦中,并从低世代相对稳定地传递到高世代,有效地在普通小麦背景中开拓出Glu-A1位点蕴含活性1Ay基因的普通小麦遗传资源。2.对杂交双亲及后代品系中的1By基因进行了分子鉴定。核酸序列比对分析显示,父本D97和后代品系TaAy7-40的1By基因的ORF长度均为2166 bp,编码720个氨基酸残基,两条序列相似度高达99.2%,而母本CN16的1By基因的ORF只有2157bp。TaAy7-40与父本D97相比存在18个SNPs,包括11个转换和7个颠换,而在后代TaAy7-40和母本CN16之间鉴定出32个SNPs,包括27个转换和5个颠换。同样,对三者预测的氨基酸一级结构分析也表明,与父本D97和后代TaAy7-40相比,在母本CN16中出现一处缺失和一处插入。通过与GenBank数据库中已有的1By等位基因序列进行比较分析,TaAy7-40的1By基因和父本D97的1By基因以高达99的自展值聚为一支,而远离母本CN16的1By序列。显然,后代TaAy7-40的活性1By基因应该是来自于父本D97的。由此可见,野生二粒小麦的活性1By基因通过远缘杂交成功地导入到普通小麦中,并从低世代相对稳定地传递到高世代,有效地拓宽了普通小麦Glu-B1位点1By基因的遗传多样性。3.稳定品系TaAy7-40根尖染色体数目为42条,处于六倍体背景,同时含有来自野生二粒小麦Glu-A1和Glu-B1位点的活性1Ay和1By基因在内的全部6个HMW-GSs。通过生物学和农艺学分析表明,该后代品系TaAy7-40株形紧凑,其开花期、植株高度、穗长、穗形、小穗数、叶形等形态学特征趋同于母本普通小麦CN16,但与其父本D97存在明显差异。TaAy7-40的籽粒长度、宽度、厚度、千粒重和单株粒重和父本D97的存在显著差异,而和CN16之间略有差异,据此认为,渐渗系材料TaAy7-40已经拥有普通小麦相应的农艺产量性状,有利地规避了品质研究籽粒浓度效应的影响。在此基础上,对TaAy7-40与母本CN16以及推广的中筋小麦品种绵麦37和内麦9号为对照的主要加工品质参数蛋白质含量、沉降值和湿面筋含量进行了测试分析,结果表明,含有野生二粒小麦活性y-型HMW-GS基因的TaAy7-40具有比其母本CN16更好的面粉加工特性,甚至超过了中筋小麦品种绵麦37和内麦9号。据此认为,野生二粒小麦y-型亚基基因可在一定程度上提高普通小麦品质,是小麦品质改良的重要基因资源。4.在上述研究的基础上,以TaAy7-40作为母本,推广中筋小麦品种内麦9号作为父本进行品种间常规杂交。利用SDS-PAGE的方法对F₂-F₅后代进行1Ay亚基的追踪筛选。从F₄代中挑选含有和没有1Ay亚基的姊妹系,其中Q1-F4-2-5-1和Q1-F4-2-5-5在HMW-GSs组成上仅在Glu-A1位点存在差异,前者包含1Ay亚基而后者缺失1Ay亚基。提取双亲和后代的DNA,对这些后代品系和亲本的1Ay基因进行分子鉴定,结果发现,父本内麦9号（MF429890）的序列长度为1812bp,比TaAy7-40少了18bp,并且还存在38个SNPs。氨基酸分析发现在父本内麦9号的340和355处出现了两个提前终止密码子,所以鉴定其为沉默的假基因。三个供试后代Q1-F4-1-6-1、Q1-F4-2-5-1、Q1-F4-2-5-5和的1Ay基因（MF429891、MF429892和MF429893）的序列长度和TaAy7-40的长度一致,均为1830bp,只是存在一些SNPs。氨基酸序列分析发现,MF429891和MF429892与母本TaAy7-40氨基酸数相同,均为608个,且中间没有出现提前终止密码子;而MF429893的氨基酸序列在148、151、286和355四处出现了提前终止密码子,确定该基因与父本的1Ay基因都是不表达蛋白的假基因。对收获的亲本和F₅代株系进行面粉加工品质参数测定,结果发现,TaAy7-40的蛋白质含量、湿面筋含量和沉降值均显著高于父本内麦9号,表明含有野生二粒小麦HMW-GS基因的TaAy7-40具有较中筋小麦品种内麦9号更好的加工品质性状,拥有更强的面筋特性。进一步比较后代与双亲之间的品质参数发现,含有活性1Ay基因的完整6个HMW-GSs基因的后代Q1-F5-2-5-1较其双亲都具有更高的蛋白质含量和面团稳定时间,而且也显著高于其姊妹系Q1-F5-2-5-5。这些结果表明,来自野生二粒小麦的活性1Ay基因对普通小麦品质具有潜在的正向作用,同时也证明,创制的含有活性1Ay亚基基因的普通小麦中间材料TaAy7-40可以作为普通小麦品质改良的种质资源被利用。