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病毒性疾病严重危害人类健康,而抗病毒药物研发却进展缓慢,因此大力开发抗病毒药物具有重要的现实意义。第一部分抗病毒药物制备、筛选及活性评价。本研究对实验室已有的纯化菌株进行液体发酵,从发酵产物中筛选有效抗病毒组分。EV71、ADV-7和H1N1作为初筛靶标。结合细胞病变(CPE)观察指标、MTT法测定病毒抑制率,检测了从113种菌株发酵液中制得的618份化合物组分的抗病毒活性。初步确认有抗EV71活性样品57份；抗ADV-7活性样品82份；抗H1N,活性样品32种。其中纯度在85%以上的化合物合计20种,新结构天然产物1种。从天然产物化学结构改造后的三个系列(脱氢表雄酮衍生物,简称W系列；芦竹碱衍生物,简称I系列；Cycloalkylthiophene亚胺衍生物,简称L系列)合计72种化合物(纯度大于95%)进行了抗病毒活性筛选。结果发现,这三个系列中均有部分化合物具有不同程度的抑制EV71和ADV-7活性。其中只有W系列中的一种化合物W-16具有抗流感病毒作用。以上筛选出来的活性较好且为纯品的化合物,分别测定了对于EV71, CVB3,ADV-7和H1N,的半数抑制浓度(EC50)以及在相应细胞上的半数毒性浓度(CC50),并计算了其选择性治疗指数(SI)。这些成果在一定程度上丰富了抗病毒化合物库,充分证明了从微生物资源以及天然结构改造化合物中寻求抗病毒药物的可行性以及其中蕴藏的巨大潜力。第二部分天然产物pimprinethine、WS-30581A和WS-30581B抗EV71研究。从微生物发酵提取的化合物中选择抗病毒活性较好的一类吲哚生物碱进行抗EV71的深入研究。经结构鉴定为pimprinethine及其两个类似物WS-30581A和WS-30581B。Pimprinethine家族化合物抑制病毒感染的能力还没有报道。药物药效学研究结果表明,三种化合物均可以强烈抑制EV71引起的RD细胞CPE,子代病毒产量以及EV71引起的RD细胞凋亡。对于pimprinethin、WS-30581A和WS-30581B抑制EV71机制进行了初步研究。药物直接杀伤病毒活性分析、预防作用分析、抑制吸附分析、治疗作用分析以及病毒释放分析结果表明,pimprinethine系列化合物既无体外直接杀伤病毒活性,对于病毒感染也无预防作用,不能抑制病毒的吸附和释放,主要抑制EV71感染细胞后的生物合成。EV71感染RD细胞后不同时间间隔给药,以期确定药物对于病毒生物合成中的具体作用环节,结果表明药物主要作用于病毒感染细胞后的增殖早期。为了进一步测定化合物对于EV71复制的影响,EV71感染RD细胞后药物处理,不同时间点取样检测各种指标。结果表明这些化合物均可以有效抑制子代病毒产量,病毒RNA合成,也可以抑制病毒蛋白合成,但是效果略差。这些结果说明这些化合物可以有效抑制病毒在细胞内的复制,并且提示化合物对于病毒RNA合成有一个直接的作用,而对于病毒蛋白合成的抑制是由于对病毒RNA合成抑制的累积作用。我们的研究表明,pimprinine家族化合物是体外EV71复制有效的抑制剂,有可能发展成为对于EV71感染的有效治疗成分。第三部分：芦竹碱(Gramine)衍生物抗EV71活性研究Gramine及其21个衍生物的抗EV71活性检测结果表明,Gramine无抗EV71活性,但是其18个衍生物显示了对于EV71不同程度的抑制作用。选择四种活性较好且结构具有代表性的化合物(4a、4i、4r和4s)测定其抑制EV71的初步机理,结果表明这些化合物抑制病毒进入细胞后的早期复制阶段,而不是直接钝化病毒颗粒,抑制病毒吸附进入,或者影响病毒从细胞中的释放。在这些衍生物中,化合物4s显示了对于EV71最强的抑制活性。进一步研究其对于EV71的复制作用,表明4s不仅能够强烈抑制病毒RNA复制,还能抑制病毒蛋白合成以及病毒导致的细胞凋亡。这些结果表明衍生物4s可能对于EV71发挥有效的治疗作用。这些Gramine衍生物可以为化合物进一步结构改造合成抗病毒药物提供有价值的导向作用。第四部分：脱氢表雄酮(DHEA)及其类似物W-3和W-12抗EV71研究从DHEA类似物中选择活性最好且治疗指数最高的两个化合物W-3和W-12,深入研究其抗EV71的作用及机制。DHEA在Vero和RD细胞上均表现出很弱的抑制EV71活性,而其衍生物W-3和W-12可以完全抑制EV71导致的Vero和RD细胞CPE。W-3具有和母体DHEA类似的细胞毒性,而W-12极大降低了细胞毒性,具有超高的治疗指数。W-3和W-12可以完全抑制子代病毒产量,而DHEA处理对于病毒滴度减少不明显。不同病毒滴度接种RD细胞检测其对于药物EC50影响,结果表明W-3和W-12能够战胜一个宽泛的病毒载量感染。我们调查了W-3和W-12抑制EV71的初步机制。W-3和W-12对于EV71均不具有直接的杀伤活性。它们不仅可以通过作用于细胞发挥间接的抗病毒作用,即具有预防作用,还可以抑制病毒的吸附内化或细胞内生物合成。但是相比较,病毒感染后加入药物这种方式所需最低浓度即可以发挥最强的抑制效果。说明药物主要作用EV71在细胞内的复制阶段。不同时间间隔加入药物试验进一步确认了上述实验结果。W-3和W-12可以强烈抑制EV71在细胞中的复制,包括RNA合成,蛋白表白,以及病毒引起的细胞凋亡。通过高效液相色谱(HPLC)分析DHEA和W-3在细胞中的代谢,结果表明它们在细胞中代谢24h后仍然稳定存在。这说明W-3是通过自身的化学构造在起抗病毒作用,而非通过DHEA和其他物质相互作用或者新的降解产物来发挥强的抗病毒活性。我们推断,W-3和W-12可以促使细胞产生某些免疫因子,使得病毒无法吸附内化或者在细胞内生物合成。类似物W-3和W-12具有的全新结构以及超强的抗病毒活性,有望发展成为新型抗病毒药物。第五部分脱氢表雄酮类似物W-16抑制流感病毒H1N1的体内外试验研究选择W-16进行抗流感病毒H1N1的体内外试验研究。体外实验结果表明,W-16对于H1N1无直接杀伤作用,在病毒感染后给药表现出对于H1N1最强的抑制活性。W-16也可以有效抑制H1N1引起的空斑形成。对W-16在Balb/c小鼠体内进行了药效研究。W-16可以改善小鼠的一般生理体征、提高小鼠存活率、延长小鼠寿命；还可以减轻小鼠肺部病变、降低肺指数、减少肺部病毒滴度。这些结果说明W-16在体内外均具有一定的抗流感病毒H1N1作用,而且结构新颖,有着较为乐观的研究前景。