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目的:顺铂是目前公认的一线抗癌药物,但有较强的肾毒性和耳毒性,其肾毒性可以通过水化疗法、利尿剂和肾保护剂的使用等方法得到明显缓解,其耳毒性除中断治疗外,尚无明确的防护措施,顺铂耳毒性的产生机制及防护方法就成为当前人们关注的热点。因此开展顺铂耳毒性的监测和防治具有重要的临床意义。
顺铂耳毒性的病理表现与氨基糖苷类抗生素相似,主要损伤耳蜗,也可累及前庭。耳蜗的毛细胞损伤可造成病人高频听力丧失,形成耳聋和耳鸣;前庭毛细胞损伤可引起病人平衡失调,导致人眩晕并丧失行动能力。内耳毛细胞死亡之后不可再生,因此如何保护毛细胞免受耳毒药的侵害是一个关键。蛋氨酸是一种必需氨基酸,主要是通过减少组织对药物的暴露时间而发挥作用,在功能及形态上均表现出了抗顺铂耳毒性的作用。目前国内外大量动物实验证明,顺铂可使实验动物发生听觉障碍并伴随听觉器官的永久性损害。这些损害主要发生在耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞,说明顺铂不但破坏听觉器官的感觉上皮而且损害周边的听觉神经元。国外最近研究了荧光标记的顺铂被耳蜗毛细胞摄取的过程,发现毛细胞是顺铂的主要靶目标。顺铂引起的动物内、外毛细胞损害总是遵循从底回向顶回的发展规律,但外毛细胞的损害比内毛细胞发生的早,因此动物总是首先发生外毛细胞的功能障碍并伴有高频听力的损失,随着内、外毛细胞损害范围的扩大,低频听力也随之发生障碍。顺铂对内耳前庭各终器同样具有损害作用。因此顺铂的耳毒性应该包括耳蜗毒性作用和前庭毒性作用。本研究目的是通过在培养基中加入顺铂、蛋氨酸以建立离体培养生后2d的昆明小鼠耳蜗毛细胞的顺铂损害模型,研究顺铂对耳蜗基底膜的损害以及蛋氨酸对耳蜗基底膜毛细胞损害的保护作用。从而为开发新的保护内耳耳蜗毛细胞的药物提供实验室依据,为抗癌药导致的耳毒性的治疗提供新的思路。
方法:对耳蜗基底膜进行离体培养,采用光镜、荧光染色、激光共聚焦、毛细胞计数等方法,观察蛋氨酸对顺铂引起的耳蜗毛细胞损伤的保护作用。具体步骤如下:
1.实验分组及模型制作
常规取出32只生后2d的昆明小鼠耳蜗基底膜随机分为4组,每组8只,分别进行耳蜗器官预培养过夜并在第二天给予相应的处理:第二天分别在不同的培养皿中换入:正常组:换入正常无血清培养液(A);实验组:换入含顺铂+蛋氨酸的无血清培养液(顺铂10μg/ml+蛋氨酸300μg/ml)(B);实验对照组1:给予含顺铂的无血清培养液(顺铂10μg/ml)(C);实验对照组2:给予含蛋氨酸(蛋氨酸300μg/ml)的无血清培养液(D)。继续在含有5％二氧化碳恒温的37℃二氧化碳培养箱内培养48小时。终止实验时吸出培养液,向培养皿中加入4％甲醛磷酸盐缓冲液并保持2小时以充分固定耳蜗组织。然后用游丝镊取下贴壁的鼠尾胶膜,再用0.1M磷酸盐缓冲液漂洗三次。然后将标本进行染色、铺片等处理后,在光镜及激光共聚焦下观察。
2.标本的制作及观察
2.1激光共聚焦显微镜标本制作及观察:
2.1.1取固定后的基底膜样品用PBS缓冲液冲洗两遍。
2.1.2将样品浸入0.25％TritonX-100溶液放置5分钟。
2.1.3样品再移入4％山羊血清磷酸盐缓冲液30分钟。
2.1.4样品浸入1:100 mysion-Ⅵ磷酸盐缓冲液,4℃冰箱过夜。
2.1.5 PBS冲洗样品3遍。
2.1.6将样品浸入1:200 FITC标记的羊抗兔二抗(IgG,1:200,Sigma,Inc.)磷酸盐缓冲液,室温下避光孵育1小时。
2.1.7 PBS冲洗样品3遍。
2.1.8用50％甘油磷酸盐缓冲液封固于载玻片上。
2.1.9激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM510,激发光波长488nm,发射光波长530nm)下观察基底膜内、外毛细胞的情况及计数(在长度为0.2毫米的显微镜取景范围内对耳蜗基底膜铺片从底回向项回逐个视野进行毛细胞计数)。
2.2光镜标本制作及观察:
2.2.1取固定后的基底膜样品用PBS缓冲液冲洗两遍。
2.2.2将样品浸入苏木素染液中浸染30秒钟。
2.2.3纯净水冲洗两遍。
2.2.4样品浸入伊红染液中复染胞浆20秒钟。
2.2.5样品经酒精梯度脱水(70％～100％)、二甲苯透明,封片后,普通光学显微镜(放大400倍)下观察基底膜内、外毛细胞的情况。
3.统计学处理:采用SPSS V13.0统计软件进行实验数据处理,所有计量资料数据以((-X)±S)表示,计量资料先行正态性和方差齐性检验,再运用完全随机单因素方差分析、最小显著差异法(LSD-t)检验处理数据。以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果:
3.1各组基底膜内、外毛细胞数量比较:
首先应用多样本正态性检验和方差齐性检验,证明四组内毛细胞数量和外毛细胞数量均服从正态分布,且数据方差齐,可以做方差分析。
然后应用单因素方差分析,内毛细胞各组间差异有统计学意义(F=40.583,P=0.000),两两比较采用最小显著差异法(LSD-t)检验,A组(正常培养液组)、B组(含蛋氨酸+顺铂培养液组)、D组(含蛋氨酸培养液组)与C组(含顺铂培养液组)的差异均有统计学意义(P值均小于0.05)。A组(正常培养液组)、D组(含蛋氨酸培养液组)与B组(含蛋氨酸+顺铂培养液组)的差异也都有统计学意义(P值均小于0.05)。B组(含蛋氨酸+顺铂培养液组)与C组(含顺铂培养液组)的差异也有统计学意义(P值小于0.05)。A组(正常培养液组)与D组(含蛋氨酸培养液组)差异不显著(P值大于0.05)。
外毛细胞各组间差异有统计学意义(F=65.718,P=0.000),两两比较采用最小显著差异法(LSD-t)检验,A组(正常培养液组)、B组(含蛋氨酸+顺铂培养液组)、D组(含蛋氨酸培养液组)与C组(含顺铂培养液组)的差异均有统计学意义(P值均小于0.05)。A组(正常培养液组)、D组(含蛋氨酸培养液组)与B组(含蛋氨酸+顺铂培养液组)的差异也都有统计学意义(P值均小于0.05)。B组(含蛋氨酸+顺铂培养液组)与C组(含顺铂培养液组)的差异也有统计学意义(P值小于0.05)。A组(正常培养液组)与D组(含蛋氨酸培养液组)差异不显著(P＞0.05)。
3.2激光共聚焦显微镜观察毛细胞(激发光波长488nm,发射光波长530m)
A组(正常培养液组)、D组(含蛋氨酸培养液组)动物耳蜗内、外毛细胞排列整齐,结构清晰,着色均匀,无缺失(Fig5、Fig6)。B组(含蛋氨酸+顺铂培养液组)、C组(含顺铂培养液组)动物内、外毛细胞均有不同程度的缺失,尤以外毛细胞最为严重,残存的外毛细胞排列紊乱,还有的甚至缺失全部外毛细胞(Fig7),而内毛细胞缺失较外毛细胞少。C组(含顺铂培养液组)(Fig8)内、外毛细胞的缺失较B组(含蛋氨酸+顺铂培养液组)(Fig9)更为严重。A组(正常培养液组)与D组(含蛋氨酸培养液组)内、外毛细胞的情况没有明显差异。
3.3光镜观察毛细胞
A组(正常培养液组)(Fig10)、D组(含蛋氨酸培养液组)(Fig11)内、外毛细胞排列整齐,轮廓清晰可数,内毛细胞的纤毛呈“一”字形排列,三排外毛细胞的纤毛呈“V”型排列无紊乱、脱失等现象。B组(含蛋氨酸+顺铂培养液组)(Fig12)可见部分外毛细胞不同程度的排列拥挤、紊乱及缺失,内毛细胞也有散乱、扭曲及缺失,但比外毛细胞损伤较轻。C组(含顺铂培养液组)(Fig13)损伤最为严重,内、外毛细胞都有大量的散乱、肿胀、移位、丢失等,甚至有片状的脱失。A组(正常培养液组)与D组(含蛋氨酸培养液组)内、外毛细胞的情况没有明显差异。
结论:顺铂破坏离体培养的生后2天昆明小鼠耳蜗基底膜毛细胞;蛋氨酸拮抗顺铂导致的耳蜗基底膜毛细胞损伤。即蛋氨酸在治疗顺铂导致的耳毒性方面起作用。