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本论文研究中药,主要是当归对小鼠骨髓细胞增殖的影响,及对MAPK,JAK—STAT两条细胞信号通路的作用。 论文分为三部分内容。 第一部分是药物的选择和作用条件的优化。根据中药的药性,选择了4种有代表性的药物,即补血药当归,理气药黄芪,滋阴药枸杞和祛风湿药雷公藤。采用这4种药物的制剂,观察对小鼠骨髓细胞增殖的影响。 粒单核祖细胞集落形成及髓过氧化物酶活性测定结果表明,当归和黄芪提取物具有促进粒单核细胞系列增殖的能力。分别检测了0.1mg/ml,1mg/ml,10mg/ml 3个不同剂量,作用有量效关系。当归提取物的作用在10mg/ml剂量较强,能增加CFU-GM形成数73%,MPO比酶活369%;而黄芪提取物的作用在1mg/ml剂量较强,使CFU-GM形成数增加22%,MPO比酶活增加96%。 枸杞中的提取物——枸杞多糖在0.01mg/ml,0.1mg/ml,1mg/ml浓度未检测到对CFU-GM形成数和MPO比酶活的影响。 雷公藤制剂——雷公藤多苷的作用是抑制性的,以0.01mg/ml,0.1mg/ml,1mg/ml三个不同浓度进行研究,1mg/ml剂量作用较强,使CFU-GM形成数下降41%,MPO比酶活下降77%。 根据上述结果,从中选择具有良好促骨髓细胞增殖能力的当归进行作用条件优化,继而进一步深入研究。 以密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离出单个核细胞,采用噻唑蓝比色法测定其生长增殖能力。分别对细胞培养第1—7天每日测定,作出细胞生长曲线。结果表明,第3天是明显的快速增殖期,适合于进一步研究。 在新鲜分离的单个核细胞中加入不同浓度的当归注射液,比较细胞生长增殖速度的变化。结果发现,1mg/ml浓度具有较强的作用效果。 常规细胞培养液中的胎牛血清含有多种促进细胞生长的活性因子,可能掩盖药物作用,因此,在短期培养中目前有许多研究采用无血清培养。我们采用10%胎牛血清,5%胎牛血清,无血清3种不同条件的培养液,观察当归的作用。 实验结果表明,无血清条件下当归注射液呈现出明显的促进细胞增殖能力,在作用较强的1mg/ml剂量,能增加单个核细胞增殖444%。而在含10%胎牛血清及5%胎牛血清的培养液,当归的促增殖作用在很大程度上被细胞的背景增殖所掩盖。因此,在后面细胞信号通路的研究中,我们采用无血清或根据方法要求采用背景很低的0.5%血清。 论文的第二部分是当归制剂对单个核细胞增殖中MAPK信号通路的影响。 MAPK细胞信号通路是调节细胞生长增殖的一条重要途径,在细胞内信号传递中起枢纽性作用。它的核心过程是MAPKKK→MAPKK→MAPK的三级传递。MAPK有多种亚型,不同的亚型引起不同的细胞变化。ERK1/2,SAPK/JNK,P38是三种主要的亚型。 MAPK蛋白通过关键位点氨基酸的磷酸化而活化,这种变化可用特异性抗体加以检测。在本文中,采用流式细胞术方法研究MAPK蛋白的活化。