近年来,胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎干细胞工程等极大地促进畜牧业的发展,而这些新技术的应用却受到的胚胎来源的制约。胚胎在体外发育过程中,常常会发生阻滞现象,潜在的机制迄今还未明了。ROS是生物体内产生的超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)等活性含氧化合物的总称。课题组前期研究表明,胚胎在体外培养过程中,会产生ROS导致胚胎氧化应激现象,但其详细的作用机理还不明确。肿瘤抑制蛋白P53作为一种细胞周期和细胞凋亡的调控者,与氧化应激反应具有密切关联,但其在胚胎中所起的作用知之甚少。所以我们假设P53在胚胎体外发育过程中在发生氧化应激时扮演重要作用,围绕ROS与P53之间的信号通路的调控作用,深入探讨ROS引起小鼠胚胎体外发育阻滞现象的机制。为此,本研究做了以下方面的实验：实验一、过氧化氢诱导的胚胎氧化应激反应首先探讨不同浓度的过氧化氢以及不同浓度抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对胚胎发育的影响,筛选出本实验最佳的胚胎氧化应激模型为后续实验做准备。结果表明,随着过氧化氢浓度的增加(25μM、50μM、100μM)胚胎4细胞发育率、囊胚率显著性降低(p<0.05),从中优选出50μM/L的过氧化氢为最佳应激浓度,且在添加不同浓度(1mM、5mM、25mM)的NAC实验中,5mM时4细胞率、囊胚率显著高于其他组(p<0.05),确定了5mM为最佳抗氧化浓度。观察胚胎内部ROS水平发现,过氧化氢能显著性增加胚胎内部ROS水平,添加NAC能显著降低胚胎中ROS水平。同时,本实验结合PI染色,发现过氧化氢刺激的胚胎PI染色相对其他组较高。为进一步评估氧化损伤程度,对脂质过氧化产物MDA测定发现,过氧化氢刺激的胚胎MDA含量显著性升高。因此,证明了一定浓度的H2O2能够引起胚胎氧化应激,导致ROS升高、MDA表达增加的胚胎发育阻滞现象。实验二、ROS诱导P53信号通路对胚胎发育的影响实验主要探讨应激后的胚胎ROS是如何调控P53及其相关信号通路的变化引起阻滞现象发生。实验结果表明,过氧化氢能够导致P53基因表达上调,细胞周期相关基因cdc2、CDK4、CDK6下调,尤其是cdc2基因显著性的降低(p<0.05),而且在蛋白水平上也发现H2O2能够引起P53-ser15磷酸化蛋白表达升高以及相应的P53蛋白高表达；为了进一步探讨ROS引起的相关基因变化是由P53介导发生,通过抑制剂PFT-α干扰P53表达,结果发现,在P53基因、P53-ser15磷酸化蛋白和P53蛋白表达显著性抑制后,GADD45、P21基因的nRNA表达水平显著性下调,而细胞周期基因cdc2的表达显著性高于对照组与过氧化氢组(p<0.05),暗示出在抑制P53表达后,相关检验点基因与细胞周期基因的表达与抑制前相比发生了明显相反改变,因此ROS引起的胚胎发育阻滞现象可能是通过氧化应激诱导P53介导的信号通路诱发的。实验三、P53在早期胚胎中的氧化还原作用本章实验继续从氧化酶的角度,更深入讨论的P53对早期胚胎体外发育的调控。实验首先观察了抑制P53的表达对胚胎内ROS水平的影响,其后测定了不同处理下对抗氧化酶和促氧化酶的基因mRNA、蛋白表达的影响,来观察P53对胚胎内氧化还原系统的影响。结果表明,抑制P53表达会增加ROS含量,抑制抗氧化酶SOD、GPX等表达。在无应激胚胎中低水平P53可以增加抗氧化酶SOD、GPX等表达,对促氧化酶BAX、PUMA等表达无影响。在胚胎受到氧化应激时,会诱导高水平P53表达,抑制抗氧化酶SOD、GPX等表达,增加促氧化酶BAX、PUMA等表达。综上所述：本实验结果表明ROS可以诱导体外发育的早期胚胎发生氧化应激现象,导致胚胎内脂质过氧化、胚胎发育受阻等现象的发生。ROS导致胚胎应激,可以诱导P53的高表达,从而刺激其下游控制检验点基因GADD45a、P21的表达来降低细胞周期进程相关基因cdc2、CDK4的表达,导致细胞发生阻滞现象。为了验证这种关系,对P53进行了抑制实验,充分证明了以上结果。此外,在对抗氧化酶与促氧化酶的研究中发现,P53可以根据其表达水平高低,来进行抗氧化酶SOD、GPX、SESN2和促氧化酶BAX、PUMA等的调控。综上所述,本实验结果揭示了ROS可通过调节P53信号通路方式对体外发育的早期胚胎产生影响。