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目的:重症哮喘的精准诊断、治疗及发病的分子机制是近年来全球研究的热点。基因组学、转录组学及蛋白组学的多组学联合分析技术是研究临床重症及难治性疾病分子机制的新手段。本课题通过基因组学及转录组学联合分析探讨了重症嗜酸粒细胞型哮喘(eosinophilic asthma,EA)患者的分子机制及其与临床特征、生物标志物相关性,为重症EA的发病机制、精准诊断及治疗提供科学依据。方法:第一部分:重症嗜酸粒细胞型哮喘患者启动子突变及其与临床特征、生物标志物的相关性研究1、受试者入选:根据入选及排除标准,2016年6月1日至2017年6月1日于解放军总医院及武警总医院呼吸科门诊就诊的重症EA患者(慢性持续期)及健康体检者中各选取30例为实验受试者;2、收集受试者基本情况、ACT评分、ACQ评分,检测受试者血常规、血总IgE、肺功能及呼出气一氧化氮(Fractional exhaled Nitric Oxide,FeNO)、诱导痰细胞计数、血及诱导痰炎症因子(IL-5、IL-8、IL-13、IL-17及骨膜蛋白);采集患者及对照组人群静脉血送检DNA目标区域靶向捕获测序;3、DNA突变位点的生物信息学分析及与生物标志物水平的关联分析。第二部分:重症嗜酸粒细胞型哮喘患者转录组学差异表达的研究1、受试者入选:随机选取重症EA患者12例,健康体检者6例;2、送检静脉血行转录组mRNA及lncRNA二代高通量测序,并对测序结果进行验证;3、mRNA及lncRNA表达谱差异分析及与启动子突变的通路联合分析。第三部分:新型lncRNA(LNC000062)在人支气管上皮细胞的调控机制研究1、应用干扰RNA沉默人支气管上皮细胞(16HBE)中的新型LNC 000062基因,设计合成3条敲减序列(Y6036、Y6037、Y6038)及1条无义序列(Y007),分别构建慢病毒稳转细胞系并通过RT-qPCR进行鉴定及验证;2、人支气管上皮细胞增殖活力及细胞凋亡检测;3、新型lncRNALNC000062对哮喘相关基因调控的影响。结果:第一部分:重症嗜酸粒细胞型哮喘患者启动子突变及其与临床特征、生物标志物的相关性研究1、DNA突变位点生物学分析:突变频率≥5%且p值<0.05的启动子及外显子SNP共32个,其中位于启动子的SNP有10个其定位于8个基因;2、重症EA患者哮喘通路突变基因筛选:选择10个启动子SNP(8个基因)关联的主要KEGG通路与哮喘的通路进行交叉比对,提示PI3K、MMP9、TSLP、MS4A2及CTLA4等5个基因的6个SNP与哮喘相关,选作后续分析研究;3、重症EA患者组与正常对照人群比较,哮喘患者血清中及诱导痰标本中IL-5、IL-13及骨膜蛋白水平哮喘组均高于正常对照组,有统计学差异(p<0.05),而IL-8、IL-17 无统计学差异(p>0.05);4、启动子突变位点与生物标志物相关分析:对重症EA患者的5个基因的6个SNP位点与血及诱导痰的生物标志物水平相关分析。其中,定位于PI3K基因启动子rs751930632与诱导痰骨膜蛋白水平、血IL-8水平有统计学意义(p<0.05)。第二部分:重症嗜酸粒细胞型哮喘患者转录组学差异表达的研究1、lncRNA筛选:根据lncRNA筛选流程,对重症EA患者332150个转录本进解放军医学院博士学位论文行过滤筛选,最终得到lncRNA数集的转录本3972个;2、差异表达lncRNA或mRNA筛选:重症EA患者组差异lncRNA共237个,其中表达上调的107个,表达下调的130个;差异mRNA共3217个,其中表达上调的1527个,表达下调的1690个;3、测序结果验证:选择|log2FC|数值排名前10的差异表达lncRNA并以GAPDH作为内参基因进行RT-qPCR验证,送检样本及扩大样本检测结果与测序结果一致;4、DNA、mRNA及lncRNA测序结果组学联合分析:对DNA测序结果选取的5个基因(PI3K、MMP9、TSLP、MS4A2及CTLA4)与重症EA患者差异表达的3217个mRNA过滤筛选,选定PI3K及MMP9两个基因,两个基因在重症EA患者中表达量上调;进一步对于PI3K及MMP9两个基因的共表达或共位置的lncRNA进行比对交叉筛选,得到1个与PI3K及MMP9两者相关的新型lncRNALNC000062,其在重症EA患者中表达量降低,log2FC值为-2.2348。第三部分:新型lncRNA(LNC000062)在人支气管上皮细胞的调控机制研究1、应用siRNA敲减人支气管上皮细胞(16HBE)中的新型lncRNALNC000062基因,通过RT-qPCR方法鉴定敲减结果,三条敲减序列均能降低LNC000062基因表达,其中Y6038敲减效率最高;无义序列Y007对LNC 000062表达无影响,两者选做后续细胞实验;2、16HBE-KD敲减组的细胞增殖活力较16HBE-NC阴性对照组及16-HBE空白对照组升高(p<0.05),而细胞凋亡比率降低(p<0.05);提示LNC000062可抑制16-HBE细胞的增殖,促进16-HBE细胞凋亡;3、16HBE-KD敲减组与16HBE-NC阴性对照组、16-HBE空白对照组比较,发现新型 lncRNALNC000062 可上调 PI3K、MMP9、TSLP、IL4、GATA3 的 mRNA表达,下调TBET mRNA及TNF mRNA表达,差异均有统计学意义(p<0.05);4、Western-Blot检测PI3K及MMP9基因的蛋白水平:PI3K及MMP9蛋白在16HBE-KD组的水平较16HBE-NC组、16-HBE组升高,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1、首次在重症嗜酸粒细胞型哮喘患者中发现,rs751930632、rs190171340、rs3806933、rs1441585,rs574700 及 rs16840252 共 6 个 SNP,分别定位于 PI3K、MMP9、TSLP、MS4A2及CTLA4等5个基因;其中PI3K基因启动子SNP位点rs751930632与患者诱导痰骨膜蛋白水平、血IL-8炎症因子水平相关,提示PI3K启动子rs751930632突变可能与重症嗜酸粒细胞型哮喘气道炎症机制相关。2、在重症嗜酸粒细胞型哮喘患者中首次发现与PI3K及MMP9两个基因相关的1个新型lncRNALNC000062,该基因在重症嗜酸粒细胞型哮喘患者外周血中表达量明显下调,参与了 PI3K及MMP9基因mRNA调控及蛋白表达的调节,提示新型lncRNALNC000062不仅可能通过TSLP、IL4、GATA3参与重症嗜酸粒细胞型哮喘患者Th2细胞活化及细胞因子分泌的调控,而且可能参与MMP9介导的气道重塑。3、新型lncRNALNC000062基因在重症嗜酸粒细胞型哮喘患者外周血中表达量明显下调,未来有可能作为重症嗜酸粒细胞型哮喘患者分子靶向诊断的新的生物标志物,为哮喘的精准诊断提供依据。4、新型lncRNA LNC000062在重症嗜酸粒细胞型哮喘患者中表达量明显下调,未来其增强剂有可能作为重症嗜酸粒细胞型哮喘患者的靶向治疗手段之一。