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双氯芬酸钠（Diclofenac Sodium,DFS）属于第三代强效非甾体抗炎药,具有良好的镇痛、抗炎及解热作用,人医临床上被广泛应用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、术后引起的疼痛以及各种原因引起的发热。相较于传统非甾体抗炎药（阿司匹林、安乃近等）双氯芬酸钠具有起效快、药效强等优点,是治疗急、慢性疼痛和炎症的首选非甾体抗炎药之一。鉴于双氯芬酸钠在同类药物中的突出优势,该药近年来也被用于兽医临床,主要治疗哺乳动物的关节炎、神经炎、各种炎症所导致的发热及术后疼痛等,安全且效果显著。然而,禽类对双氯芬酸钠极为敏感,双氯芬酸钠极易引起禽类的中毒反应并导致死亡,剖检主要表现为内脏弥漫性尿酸盐沉积。目前关于双氯芬酸钠致禽类毒性的研究较少,本课题以肉鸡作为试验动物,从临床表现、病理解剖、组织病理学、血清生化指标及蛋白质组学等方面探究双氯芬酸钠对肉鸡的毒性作用,以揭示双氯芬酸钠对肉鸡的毒性作用机制。主要研究内容及结果如下:1.双氯芬酸钠对肉鸡的急性毒性研究为确定双氯芬酸钠对肉鸡的毒性作用,选择阿司匹林和安乃近作为对照药物,采用急性经口毒性试验中的霍恩（Horn）氏法,分别测定了三种药物对肉鸡的口服半数致死量(LD50)。结果表明,双氯芬酸钠对肉鸡的口服LD50为23.3 mg/kg,95%置信区间为16.0～39.9 mg/kg;阿司匹林对肉鸡的口服LD50为1260 mg/kg,95%置信区间为926～1710 mg/kg;安乃近对肉鸡的口服LD50为2710 mg/kg,95%置信区间为2000～3690 mg/kg。LD50试验结果证明肉鸡对双氯芬酸钠的敏感性远高于同类药物阿司匹林和安乃近,测得的药物的LD50为后续试验给药剂量的选择提供了参考。2.双氯芬酸钠在肉鸡体内的组织分布研究为研究双氯芬酸钠在肉鸡体内的吸收情况,建立高效液相色谱（HPLC）检测方法,分别测定了以10 mg/kg的剂量口服给药后2 h、4 h、8 h及12 h肉鸡血浆和组织样品中的双氯芬酸钠含量。样品测定结果表明,双氯芬酸钠口服给药后不同时间点在血液及多种组织中均检测到了药物的存在,证明肉鸡口服双氯芬酸钠能够经胃肠道吸收并能在各组织中分布,这是研究双氯芬酸钠产生全身毒性反应的依据和理论基础。3.双氯芬酸钠对肉鸡毒性作用的评估为系统性评估双氯芬酸钠对肉鸡的毒性作用,参考急性毒性试验肉鸡口服双氯芬酸钠的LD50,选择适当的剂量（10 mg/kg和20 mg/kg）对肉鸡灌胃给予双氯芬酸钠,从临床症状、剖检变化、病理组织学和血清生化指标等方面研究双氯芬酸钠对肉鸡的毒性作用。随后以较低剂量（2.5 mg/kg和5.0 mg/kg）的双氯芬酸钠对肉鸡单次灌胃给药,通过对72 h内多个时间点血清尿酸含量进行检测,探究双氯芬酸钠毒性与尿酸含量间的关联。结果表明,肉鸡口服双氯芬酸钠中毒后,以精神沉郁、卧地不起为主要临床表现,剖检可见内脏器官表面覆盖弥漫性的白色尿酸盐。组织病理学观察发现,肉鸡各内脏器官均呈现不同程度的损伤,其中肾脏、肝脏及十二指肠最为严重。血清生化指标显示,血清中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酐（Crea）、乳酸脱氢酶（LDH）、钾离子（K+）和尿酸（UA）的水平显著上升,葡萄糖（GLU）、钙离子(Ca2+)和甘油三酯（TG）的水平显著降低,其中Crea和UA的变化最为显著,Crea上调最高达5倍左右,UA上调最高达7倍左右。血清中UA含量检测结果显示,双氯芬酸钠给药后肉鸡血清UA含量迅速上升,2.5 mg/kg组UA在第2 h达峰值,为空白对照组的2.5倍;5.0 mg/kg组UA的达峰时间为8 h,为空白对照组的7.5倍。综上结果,肉鸡口服给予双氯芬酸钠后可导致内脏各组织器官的病理损伤,具有极强的肝毒性和肾毒性,其毒性作用与影响机体尿酸的代谢有关,血清UA含量的升高与双氯芬酸钠存在剂量依赖性。4.蛋白质组学分析双氯芬酸钠对肉鸡肾脏的毒性作用肾脏是双氯芬酸钠对肉鸡造成毒性损伤的主要器官,为了探究双氯芬酸钠对肾脏的毒性作用机制,采集10 mg/kg给药组中肉鸡的肾脏组织进行蛋白质组学分析,并通过q RT-PCR对筛选的差异蛋白进行验证。结果显示,肉鸡口服双氯芬酸钠后,依据差异倍数1.2倍以上和P＜0.05的原则,筛选出434个差异蛋白,其中277个上调,157个下调;GO富集分析显示差异蛋白广泛参与代谢过程,如有机物代谢过程、初级代谢过程、细胞代谢过程及氮化合物代谢过程等;KEGG通路分析表明DEPs主要富集于代谢相关通路,如“内质网的蛋白质加工”、“丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢”、“氨基酸的生物合成”、“乙醛酸和二羧酸代谢”、“丙酸代谢”、“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢”、“氮代谢”等通路。双氯芬酸钠可通过引起内质网应激,诱导肾脏细胞凋亡;通过上调GSL、GPT2、PIPOX、ASNS,下调ABAT、GLDC、AGXT2、GLUD1和GATM等参与嘌呤环生物合成过程中的蛋白进而影响尿酸的生成;通过抑制尿酸盐转运蛋白OAT2（基因为SLC22A7）,抑制尿酸的排泄。制备鸡胚肾（CEK）细胞,通过CCK-8法测定细胞存活率发现双氯芬酸钠对CEK细胞的半抑制浓度(IC50)为1.355 m M,95%置信区间为1.280～1.434 m M。5.蛋白质组学分析双氯芬酸钠对肉鸡肝脏的毒性作用为了探究双氯芬酸钠对肝脏的毒性作用机制,采集10 mg/kg给药组中肉鸡肝脏组织进行蛋白质组学分析,并通过q RT-PCR对筛选的差异蛋白进行验证。结果显示,肉鸡口服双氯芬酸钠后,依据差异倍数1.2倍以上和P＜0.05的原则,共筛选出201个差异蛋白,其中47个上调,154个下调;GO富集分析显示差异蛋白主要参与代谢过程,如有机物代谢过程、氮化合物代谢过程、初级代谢过程、细胞代谢过程、分解代谢过程等;KEGG通路分析表明肝脏中的差异蛋白主要富集于“内质网的蛋白质加工”、“视黄醇的新陈代谢”、“甾类激素生物合成”、“亚油酸的新陈代谢”、“细胞色素P450对外源物质的代谢”及“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢”等通路。双氯芬酸钠通过引起内质网应激,诱导肝脏细胞凋亡;通过上调CYP3A5,下调CYP3A4、CYP2C45、BCO1及UGT1A1调控视黄醇代谢,诱导肝细胞氧化应激损伤;通过下调TDH、LOC101747660及GATM等参与嘌呤环生物合成过程的蛋白,进而影响尿酸的生成。综上所述,双氯芬酸钠对肉鸡具有极强的毒性作用,LD50为23.3 mg/kg。通过建立基于HPLC技术测定肉鸡血浆及组织样品中双氯芬酸钠含量的方法,发现双氯芬酸钠经胃肠道吸收后可在肉鸡体内广泛分布,这是双氯芬酸钠产生全身毒性反应的依据和理论基础。双氯芬酸钠能够造成肉鸡多组织器官的损伤、血清中UA含量显著上升和高血钾症。蛋白质组学分析发现,双氯芬酸钠通过诱导肾细胞凋亡、干扰嘌呤代谢及抑制尿酸盐转运蛋白OAT2的表达产生肾毒性,通过诱导肝细胞凋亡、干扰视黄醇和嘌呤代谢产生肝毒性。本研究结果为阐明双氯芬酸钠对肉鸡的毒性提供了理论依据,为研究双氯芬酸钠对禽类的风险评估提供了参考,同时对生态环保也具有一定的警示意义。