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乳腺癌是一种常见的、高发的恶性肿瘤,在女性恶性病发病率中排名第一位,是导致全球女性死亡的主要原因;经研究表明,在全球范围内,每年约有50万新增病例,约有25万人死于乳腺癌。乳腺癌在其发生的初期阶段,往往只单纯的表现为细胞的过度增殖及凋亡的异常减少,最终导致肿瘤的快速生长;在其发生发展的晚期阶段,转移成为导致病人死亡的一个最重要的因素,而骨是乳腺癌转移中最常见的靶器官。PTHrP是从高钙血症相关的恶性肿瘤组织中分离出来的一种蛋白质,由于其结构及功能与甲状旁腺激素PTH相类似而得名;多项研究表明PTHrP在乳腺癌微环境中呈现过度表达的状态,它通过上调骨组织中成骨细胞及基质细胞RANKL的表达,抑制OPG的表达,RANKL与破骨细胞RANK结合从而间接激活破骨细胞,诱导其分化成熟;PTHrP在肿瘤溶骨性骨转移及骨破坏的发生发展过程中起着至关重要的作用,同时也有报道称其与乳腺癌的预后有一定的关联性。研究目的探讨乳腺癌细胞自身产生的细胞因子PTHrP对成骨细胞增殖与分化的影响;对破骨细胞增殖及分化的影响;对肿瘤细胞自身增殖,凋亡及自噬作用的影响。研究内容及方法本课题采用慢病毒包装的shRNA感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231并用嘌呤霉素筛选的方法,通过RT-PCR及Elisa检测,得到稳定敲降PTHrP的细胞株995,996以及阴性对照组细胞NC。体外通过成骨分化标志分子OCN/OSX/Runx2/ALP/BSP相对表达量检测,破骨分化标志分子CatK/RANK/Trap/MMP-9相对表达量检测,ALP活性检测,茜素红矿化染色,Trap染色等方法,观察NC,995,996三种细胞的条件培养基对成骨细胞及破骨细胞增殖及分化影响的差别;体内通过影像学X射线平片,免疫组化等检测手段,观察Balb/C裸鼠胫骨内注射NC,995,996三种细胞以及空白对照Blank 28天后对成骨细胞及破骨细胞影响的差别;体外通过流式细胞周期分析,细胞凋亡相关蛋白Caspase8/bcl-2相对表达量检测,细胞自噬标志蛋白LC3A/B/Beclinl相对表达量检测,透射电镜,CCK-8法细胞增殖曲线检测等方法,观察NC,995,996三种细胞体外增殖,凋亡及自噬作用的差异;体内通过NC,995,996三种细胞Balb/C裸鼠皮下成瘤瘤体生长曲线,瘤体大小及重量,瘤体石蜡切片免疫组化染色结果,观察995,996,NC三种细胞体内增殖,凋亡和自噬作用的差别。研究结果与结论+本课题揭示了无论体内还是体外,乳腺癌细胞自身产生的细胞因子PTHrP能够直接抑制成骨细胞的增殖与分化同时诱导破骨细胞的增殖与分化;无论体内还是体外,乳腺癌细胞自身产生的细胞因子PTHrP能增强自身的增殖作用,抑制凋亡与自噬作用,促进转移至骨组织的癌细胞适应转移灶微环境,为其恶性增殖提供有利保障;乳腺癌细胞自身产生的细胞因子PTHrP能上调自身IL-6的表达,为乳腺癌细胞能够直接作用于破骨细胞,诱导其分化成熟提供了一定的理论依据。