第一章 非小细胞肺癌脑转移EGFR基因突变状况的一致性研究背景：肺癌是全球最常见的恶性肿瘤,发病率和死亡率居恶性肿瘤的首位,其中男性恶性肿瘤死亡患者中占31%,女性占26%。大约80%的肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC),而非小细胞肺癌是目前发生脑转移最多的恶性肿瘤之一,大约25-38%的非小细胞肺癌患者发生脑转移。脑转移的发生预示着预后往往较差,是非小细胞肺癌晚期重要临床表现之一,也是主要的致死因素。非小细胞肺癌脑转移常规的治疗方法有手术治疗、全脑放射治疗(WBRT)、立体定向放射治疗(SRT)和化疗等,如果脑转移瘤未作任何治疗,中位生存时间为4-11周,使用激素可以延长至2个月。采用全脑放射治疗则有改善,中位生存时间可达3-6个月。对于单发的脑转移灶可以采取手术切除或立体定向放射外科治疗。联合全脑放射治疗和手术或立体定向放射外科治疗可以改善总生存期,中位生存时间可达6-11个月。对于多发脑转移瘤,全脑放射治疗还是标准的治疗方案,有效率可达25-30%。脑转移瘤的化疗目前还存在争议,因为化疗药物难以通过血脑屏障效果而大打折扣。总的来说,通过手术、全脑放射治疗、立体定向放射外科治疗及辅助化疗等综合性的治疗,中位生存时间可以提高至8.8个月。但尽管如此,非小细胞肺癌脑转移的预后仍然很差,中位总生存期不超过1年。随着肿瘤分子病理学研究的深入,带动了非小细胞肺癌脑转移靶向治疗的发展。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因在非小细胞肺癌中高表达,是非小细胞肺癌病情发展的重要指标。EGFR基因含有28个外显子,突变位点主要位于18-21外显子,在不同种属组中存在29种基因突变类型。已证实EGFR基因突变的非小细胞肺癌患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)非常敏感,并能明显改善预后。EGFR基因突变型的非小细胞肺癌患者对EGFR-TKIs治疗有效率可达60-80%。并且,在非小细胞肺癌脑转移的患者中,尽管有血脑屏障的作用,应用EGFR-TKIs治疗同样有效,并能明显改善功能并延长生存期。在不同的种族、不同地区的人群非小细胞肺癌EGFR基因突变发生率不同,在亚洲30%,高加索地区10%,北美地区3-25%,中国地区大约50%。国内外报道称非小细胞肺癌肺部原发病灶与淋巴结转移灶、骨转移灶和其它如肾上腺等转移灶的EGFR基因表达存在差异的可能,如有报道称非小细胞肺癌原发病灶与淋巴结转移灶之间的EGFR基因表达不一致率达11.9%。但脑转移病灶的EGFR基因突变状况是否与非小细胞肺癌原发病灶保持一致,目前尚存在争论。有学者认为脑转移病灶的EGFR基因突变与原发病灶表达一致,一致率高度100%；有学者认为脑转移病灶的EGFR基因突变与原发病灶表达不一致,不一致率0-30%。在临床上,脑转移病灶的发生是非小细胞肺癌晚期重要临床表现之一。对于这种进展型的非小细胞肺癌,为了检测EGFR突变以决定是否行靶向治疗,多数情况下可能会选择肺部原发病灶的病理活检,如经纤支镜活检或穿刺活检等,而没有去获取脑转移病灶的病理。但也有另外一种情况,患者因脑转移病灶症状而首诊,先行颅脑手术切除或活检,进一步而明确诊断为非小细胞肺癌,这时脑转移组织样本就可首先用来检测EGFR突变以决定是否行靶向治疗。不管是何种情形,如果可以明确脑转移病灶的EGFR基因突变状况,明确脑转移病灶与肺部原发病灶EGFR表达是否一致,找出预测的因素,通过任一病灶的检测结果来预测其它病灶的EGFR突变状况,以此指导靶向治疗,这在临床应用时非常重要的。目的：研究非小细胞肺癌脑转移病灶和肺部原发病灶的EGFR基因突变的状况,探讨两者的一致性,明确临床预测因素。方法：收集2007年11月-2012年11月华南地区八家医院136例非小细胞肺癌病例的脑转移病灶的石蜡包埋组织样本及15对肺部原发病灶和脑转移病灶的石蜡包埋组织样本。(1)病理组织样本组织切片；(2)使用QIAamp福尔马林固定石蜡包埋DNA提取试剂盒进行DNA提取,使用商用的人核糖核酸酶P基因Taqman试剂盒,通过实时定量PCR方法控制DNA质量；(3)应用扩增耐突变系统(amplification mutation refractory system,ARMS),使用EGFR突变检测试剂盒检测非小细胞肺癌常见的29种EGFR突变类型。(4)采用SPSS 13.0统计分析软件进行实验数据的统计分析,采用McNemar’s test和Pearson Chi-square test统计方法分析数据,P<0.05表示有显著性统计学意义。结果：(1)136例非小细胞肺癌脑转移患者中,72例(52.9%)发生EGFR基因突变；(2)72例非小细胞肺癌脑转移EGFR基因突变患者中26例(36.1%)存在21外显子L858R点突变,36例(50.0%)存在19外显子缺失突变,6例(8.3%)存在19外显子缺失突变和21外显子L858R点突变,1例(1.4%)存在21外显子G719X和L858R点突变,1例(1.4%)存在19外显子缺失突变和21外显子G719X点突变,1例(1.4%)存在19外显子缺失突变和20外显子插入突变,1例(1.4%)存在21外显子L961Q点突变。19-Del在非小细胞肺癌脑转移灶EGFR基因突变中最为常见,占50.0%(36/72)；L858R次之,36.1%(26/72)；19-Del/L858R、G719X/L861Q、19-Del/G719X、19-DeL/20-Ins与L861Q则为更少。(3)15对非小细胞肺癌脑转移患者中,14对原发病灶与脑转移病灶EGFR基因表达一致,一致率高达93.3%(McNemar’s test, P=1.000; Kappa test, κ=0.867, P <0.001);(4)15例非小细胞肺癌肺部原发病灶与136例脑转移病灶EGFR基因表达高度一致(Pearson Chisquare test,X2=0.213, P=0.644);(5)非小细胞肺癌肺原发病灶预测脑转移病灶EGFR基因表达情况的阳性预测值(PPV)为100.0%(7/7),阴性预测值(NPV)87.5%(7/8)；反之,脑转移病灶预测肺原发病灶EGFR基因表达情况的阳性预测值为87.5%(7/8),阴性预测值为100.0%(7/7)。结论：非小细胞肺癌脑转移病灶的EGFR基因突变率52.9%,肺原发病灶46.7%。脑转移病灶EGFR基因突变最常见于19外显子19-Del突变,其次为21外显子L858R突变。脑转移病灶与肺原发病灶的EGFR基因突变状况呈高度一致,一致率93.3%。肺原发病灶与脑转移病灶两者任何一个的EGFR基因检测结果可以用来作为另一个的预测因素,以此指导临床的EGFR-TKIs的应用。第二章 非小细胞肺癌脑转移EGFR基因突变对患者生存期的影响背景：肺癌是最常见的恶性肿瘤,发病率和死亡率居恶性肿瘤的首位,其中男性和女性恶性肿瘤死亡患者比例分别是31%和26%。80%是非小细胞肺癌,大约25-38%的非小细胞肺癌患者发生脑转移,其中腺癌脑转移最为常见,发生率高达43%。脑转移瘤侵袭性强,预后很差,生活质量低,自然中位生存期仅为1-2个月,使用激素可以延长生存时间。目前,非小细胞肺癌脑转移的治疗方法有手术切除、立体定向放射外科治疗、全脑放射治疗、化疗分子靶向治疗和综合治疗等。已证实EGFR基因突变的非小细胞肺癌患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)非常敏感,并能明显改善预后。有报道,不同的人群,不同的种族,不同的性别,是否有吸烟史,EGFR基因突变的发生率有不同。病理类型的不同,EGFR突变发生率也有不同。有报道非小细胞肺癌脑转移病灶EGFR基因突变与肺部原发病灶、临床分期等无明显相关。但也有报道EGFR基因突变状况会影响脑转移,包括脑转移瘤的多寡、个数和大小。目前,国内外对非小细胞肺癌脑转移EGFR基因突变的状况与其临床特征的关系无明确的认识。因此,探讨非小细胞肺癌脑转移病灶EGFR基因突变的状况与临床特征的关系,对临床分子靶向治疗与非小细胞肺癌脑转移预后的预测有着重要的意义。国内外有较多关于非小细胞肺癌脑转移预后影响因素的研究,包括年龄、性别、KPS评分、脑转移病灶的数目大小、组织病理情况、治疗方法等,各种结论不一,尚未有统一的定论。有报道非小细胞肺癌脑转移的预后与年龄、KPS评分、脑转移的数目、组织病理有关,但另外的报道却认为无关。对于治疗方法,报道称非小细胞肺癌脑转移的生存期与治疗方法有关,手术治疗或r刀治疗中位生存时间最长,联合放疗及化疗比单纯放疗或化疗生存期要长。已证实EGFR突变的非小细胞肺癌脑转移对EGFR-TKIs治疗敏感,因此,有报道认为EGFR基因突变是非小细胞肺癌独立的预后预测因素,但这是EGFR突变状况影响了预后还是EGFR-TKIs影响了预后,目前没有统一的认识。因此,探讨脑转移病灶EGFR基因突变状况与非小细胞肺癌脑转移术后的生存期的关系,明确预后预测的因素,对临床应用分子靶向治疗有着重要的意义。目的：探讨非小细胞肺癌脑转移病灶EGFR基因突变状况与临床特征的关系；探讨非小细胞肺癌脑转移病灶EGFR基因突变状况对无进展生存期和总生存期的影响,以明确非小细胞肺癌脑转移病灶术后的预后预测因素。方法：回顾性收集136例非小细胞肺癌脑转移患者临床资料,包括年龄、性别、吸烟史、KPS评分、肿瘤分期、肺部原发病灶部位、脑转移病灶分布部位、脑转移病灶大小、肿瘤病理分级、肿瘤病理分类、首诊时肺部症状、首诊时中枢神经系统症状、治疗方法等。(1)预后随访：收集136例非小细胞肺癌脑转移患者的临床资料和生存资料,进行总生存期(overall survival,OS)和无进展生存期(progression-free survival,PFS)的计算；(2)按照第一章的实验方法,采集136例非小细胞肺癌脑转移病理组织样本,采用扩增耐突变系统(ARMS)检测EGFR突变,并记录；(3)将136例非小细胞肺癌脑转移患者按治疗方法分组,包括WBRT组(全脑放射治疗组)、化疗组、WBRT+化疗组、无辅助治疗组；(4)统计分析：采用SPSS 13.0统计学软件进行分析。采用χ2检验和非参数秩和检验比较脑转移病灶EGFR基因突变状况与临床特征的关系；采用t检验统计分析EGFR基因野生型和突变型亚组间WBRT+化疗组与无辅助治疗组无进展生存期和总生存期的差异；采用Kaplan-Meier曲线统计各亚组EGFR突变型和野生型对无进展生存期和总生存期的影响,用log-rank检验统计分析；运用Cox回归模型进行多因素分析。P<0.05表示有显著性统计学意义。结果：(1)临床结果1)不同年龄组非小细胞肺癌脑转移灶EGFR基因突变无显著性差异(χ2=1.106,P=0.293)；2)女性更易出现脑转移病灶EGFR基因突变(χ2=24.118,P<0.01)；3)无吸烟史患者脑转移病灶EGFR基因突变率更高(χ2=23.314,P<0.01)：4)不同脑转移病灶组织病理类型EGFR基因突变无显著性差异(χ2=4.946,P=0.176)：(2)生存分析：(136例患者随访中39例因失访而缺失,研究对象为97例)1)97例非小细胞肺癌脑转移患者中位无进展生存期为11个月,95%置信区间8.77-13.23,脑转移灶EGFR基因野生型与突变型的无进展生存期无显著性统计学差异(χ2：0.284,P=0.594)。中位总生存期18个月,95%置信区间10.48-25.53,脑转移灶EGFR基因野生型与突变型的总生存期无显著性统计学差异(χ2=1.337,P=0.248)。2)WBRT组：脑转移灶EGFR基因野生型和突变型的无进展生存期(χ2=0.296,P=0.604)和总生存期(χ2=0.107,P=0.743)无显著性统计学差异。3)化疗组：脑转移灶EGFR基因野生型和突变型的无进展生存期(χ2=0.235,P=0.628)和总生存期(χ2=0.011,P=0.915)无显著性统计学差异。4) WBRT+化疗组：脑转移灶EGFR基因野生型和突变型的无进展生存期(χ2=0.001,P=0.0.978)和总生存期(χ2=0.003,P=0.956)无显著性统计学差异。5)无辅助治疗组：脑转移灶EGFR基因野生型和突变型的无进展生存期(χ2=0.0.262,P=0.609)和总生存期(χ2=0.253,P=0.615)无显著性统计学差异。(3)97例非小细胞肺癌脑转移患者WBRT+化疗组与无辅助治疗组无进展生存时间分别为为14.23±10.11和8.58±7.18个月(t=2.333,P=0.024),总生存时间分别为26.46±20.98和11.26±7.53个月(t=2.745,P=0.001)；WT亚组中,术后联合全脑放射治疗及化疗无进展生存期(t=2.177,P=0.038)和总生存期(t=3.140,P=0.005)明显延长；MT亚组中,术后联合全脑放射治疗及化疗无进展生存期(t-=0.667,P=0.513)和总生存期(t=0.469,P=0.645)无明显改善。(4)多因素分析：97例患者纳入术后无进展生存期的研究,整体模型检验(χ2=5.751,P=0.016)具有意义,非小细胞肺癌脑转移术后无进展生存期与化疗有关(HR=1.68)；97例患者纳入术后总生存期的研究,整体模型检验(χ2=25.375,P<0.01)具有意义,总生存期与WBRT(HR=2.17)和化疗(HR=2.21)有关。结论：(1)非小细胞肺癌脑转移EGFR基因突变在女性和非吸烟患者中发生率高；(2) EGFR基因突变状况对非小细胞肺癌脑转移术后无进展生存期和总生存期无影响；(3)联合全脑放射治疗和化疗对非小细胞肺癌脑转移术后无进展生存期和总生存期有影响；EGFR野生型的非小细胞肺癌脑转移患者联合全脑放射治疗和化疗可以明显改善无进展生存期和总生存期。(4)治疗方法是非小细胞肺癌脑转移术后预后的影响因素。