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华支睾吸虫病是由于华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)寄生于人、猫、犬等动物的肝脏和胆囊内而引起的一种人兽共患寄生虫病。近年来,华支睾吸虫的研究主要集中在其形态特征的描述、生活史的研究及华支睾吸虫病的流行病学调查、诊断、药物防治和预防措施等方面,关于其分子分类和重组抗原的研究少见报道。核糖体DNA(rDNA)是细胞核内编码核糖体RNA的基因,由内部转录间隔区(ITS)和3种核糖体基因编码区(18S、5.8S、28S)等组成,不同区域其进化速率不同。线粒体DNA(mtDNA)为母系遗传,其基因间很少重组,所以可以反映出母系的进化历史,这样线粒体一个基因就可以代表整个线粒体基因组的变异情况。因此,本实验以华支睾吸虫核糖体内转录间隔区1(ITS1)基因、线粒体细胞色素c氧化酶亚基2(COX2)基因和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基3(NAD3)基因为研究对象,对目的片段进行克隆和序列测定,构建分子系统发生树,来探讨华支睾吸虫在后睾科中的系统发生位置。谷胱甘肽S转移酶(GSTs)是广泛存在于各种生物体内的一组抗氧化反应同工酶,通过催化内源性和外源性毒素与谷胱甘肽的结合,从而解除毒性复合物的毒性,对寄生虫在宿主体内存活发挥着重要作用。同时,GSTs具有较强的免疫原性,可用于免疫诊断或作为候选疫苗分子用于免疫预防。本研究以采自宾县、大庆、海伦、双城、泰来、同江和长春7个地区的华支睾吸虫为研究对象,经PCR扩增ITS1、COX2和NAD3基因,采用序列分析方法研究不同地区华支睾吸虫ITS1、COX2和NAD3基因的多态性,并与GenBank登录的麝猫后睾吸虫、猫后睾属吸虫、东方次睾吸虫、广西株、沈阳株、韩国株和美国株华支睾吸虫等进行比对分析。使用Phylip3.66软件采用邻接法(NJ)绘制系统发生树。序列分析结果表明,华支睾吸虫核糖体ITS1、COX2和NAD3编码基因大小分别为661 bp,636 bp和357 bp;不同地区华支睾吸虫ITS1、COX2和NAD3基因序列存不同程度的差异,同源性分别在99.4 %~100 %、98.9 %~100 %和99.2 %~100 %之间。以肝片形吸虫作外群,基于ITS1、COX2和NAD3基因序列采用NJ法构建的系统发生树,其结果一致,均显示华支睾吸虫的分类地位处于后睾科内,同时证明各地区存在差异。以上结果显示:ITS1、COX2和NAD3基因均可作为遗传标记用以鉴定华支睾吸虫在后睾科的位置,科内属间的遗传关系,还可以用来区分属下种间的遗传关系。提取人源华支睾吸虫总RNA,应用RT-PCR技术扩增出华支睾吸虫28ku谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)基因。对此基因片段进行克隆,经鉴定正确后,亚克隆到表达载体pET-32a(+)上,构建重组质粒pET-32a(+)-GSTs,转化大肠埃希菌BL21中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;表达产物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western blot)分析和鉴定。本研究结果显示人源华支睾吸虫GSTs编码区含有639个碱基,编码212个氨基酸残基;表达的蛋白存在于上清中,大小约为42.68ku,可被感染华支睾吸虫人的阳性血清识别,证明GSTs基因可在原核表达系统中高效表达并具有反应原性。