论文部分内容阅读
志贺氏菌属(Shigellaspp.)细菌俗称痢疾杆菌,是一类兼性厌氧、不产生芽孢的革兰氏阴性杆菌,可以侵入结肠上皮,并在结肠中繁殖,导致强烈的炎症反应和上皮损伤。据WHO统计,全球每年约有1.647亿人感染痢疾,110万人死亡,大多数为发展中国家的儿童。福氏志贺氏菌是发展中国家主要的感染菌株,福氏2a志4贺氏菌是主要的血清型。我国每年大约有2000万人次感染痢疾,感染或大流行的痢疾杆菌中50-70%是由福氏2a志贺氏菌引起的,因此,福氏2a志贺氏菌的基础研究对于我国卫生防疫工作尤为重要。
志贺氏菌毒力基因的表达和调控对其致病性至关重要。迄今为止,痢疾杆菌毒力基因和致病性的关系还不明晰。因此,探求已知毒力因子作用的分子机制,寻找新的毒力基因成为志贺氏菌研究的热点。
Mxi-spa基因簇位于福氏志贺氏菌的毒力质粒,编码细菌Ⅲ型分泌系统的组成成分。mxiE即定位于此基因簇,编码一个与AraC/XylS转录调节子家族同源的蛋白,其在志贺氏菌侵袭过程中所起的作用甚不清楚。本研究采用改进的λ-Red重组系统成功构建了mxiE基因缺失突变株,对突变株进行了生理生化特征研究。结果表明:mxiE的缺失对菌体的生长影响不大;相比于野生株,突变株利用甘露糖的能力增强,而利用葡萄糖的能力降低。
突变株和野生株的毒力蛋白差异表达是评价基因功能的一个重要依据。本研究采用WesternBlotting方法考察了突变株和野生株毒力蛋白IpaB(侵袭所需的效应因子)的分泌能力;采用双向凝胶电泳建立了不同生长时期、诱导条件下,野生株和mxiE突变株的双向电泳图谱,并对差异点进行了胶内酶切和质谱鉴定。结果表明:mxiE基因缺失突变株依然分泌毒力蛋白IpaB;在不同生长时期和诱导条件下,野生株和mxiE突变株的双向电泳呈现差异,毒力相关蛋白PhoN2、OmpA和HtrA在mxiE基因缺失突变株中表达下调。
评价mxiE基因的功能,除了在蛋白水平上研究毒力蛋白的表达差异,还需通过动物实验模型进行功能验证。本研究采用豚鼠角膜侵袭实验、细胞侵袭实验和小鼠肺部侵袭炎症实验等毒力评价模型评价了mxiE突变株对福氏志贺氏菌毒力的影响。结果表明:突变株在引起豚鼠角膜反应时间、炎症强度方面都显著弱于野生株。体外细胞侵袭实验中,mxiE基因缺失突变株表现出侵袭上皮细胞的能力,其侵袭能力却低于野生株。体内侵袭试验中,mxiE基因缺失突变体的侵袭能力有部分的恢复,尚呈现显著的减毒趋势。
综上所述:MxiE对福氏志贺氏菌的代谢影响不大,其缺失会使志贺氏菌毒力显著下降。