蛋白酶作为一类重要的生物标志物,参与肿瘤的发生与转移,同时在体内活性与表达水平的变化与疾病发展息息相关,因此被广泛用作临床诊断中肿瘤发病机理和预后的可测量指标。尽管现有的检测方法可以实现对蛋白酶的检测,但是由于无法同时满足临床诊断中高特异性和灵敏性的检测需求,因此仍然需要开发出更有效的方法实现蛋白酶的检测。近来,包括Cas12a、Cas12b、Cas13a和Cas14a在内的几种二类CRISPR-Cas系统由于对非靶标ss DNA或RNA展示出较强的非特异性切割活性而呈现优异的信号放大能力,因此我们尝试基于CRISPR-Cas开发一种高灵敏的蛋白酶检测方法。考虑到蛋白酶靶标无法直接激活CRISPR-Cas的非特异性切割活性,在本文我们通过引入蛋白酶激活的RNA聚合酶（PR）,成功的开发了一个基于CRISPR-Cas和可激活RNA聚合酶的蛋白酶检测新方法（PR-Cas）。该PR-Cas系统不仅可以实现CRISPR在蛋白酶检测领域的应用,还为蛋白酶生物标志物的超灵敏度检测提供了新的策略,同时还可实现临床实际样本的检测。本文具体工作如下:1、表达与纯化PRThr、PRMMP-2和Lb Cas12a蛋白。将在大肠杆菌中诱导表达的PRThr、PRMMP-2和Lb Cas12a蛋白通过Ni-NTA亲和层析法纯化,再分别验证PRThr、PRMMP-2的信号转换能力和Lb Cas12a的酶切活性,为后续两者的偶联及其在蛋白酶检测、癌细胞的区分和癌症诊断中奠定基础。2、构建基于CRISPR-Cas和可激活RNA聚合酶的蛋白酶检测新方法。首先通过探究Lb Cas12a的cr RNA最适引导序列长度,确保后续PR和Lb Cas12a的有效偶联。然后以凝血酶为模型,利用上一章所构建的PRThr成功的将凝血酶信号转换为多个cr RNA输出,从而激活Lb Cas12a的非特异性切割活性,实现对凝血酶的放大检测（检测限低至31.6 f M）。该PRThr-Cas不仅实现了蛋白酶的高灵敏和特异性检测,同时拓展了CRISPR-Cas在蛋白酶检测中的应用,为后续蛋白酶的检测提供了新的平台。3、基于CRISPR-Cas和可激活RNA聚合酶的蛋白酶检测新方法在MMP-2检测中的应用。基于上一章PRThr-Cas的成功构建及应用,我们在此基础上通过改变PR的连接底物肽,设计了能响应MMP-2的PR(PRMMP-2)。由于PRMMP-2-Cas合理的将PRMMP-2的信号转换和放大能力与Lb Cas12a系统的信号放大能力相结合,使得PRMMP-2-Cas可以实现对MMP-2的超灵敏检测,检测限为5.4 f M。并且根据MMP-2表达水平的差异,PRMMP-2-Cas还可被进一步应用于细胞的区分和癌症血液样本的检测。