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研究目的:1、根据组织微环境中PD-L1状态、CD8+T细胞浸润情况以及MICA状态初步对胃癌的免疫分型,探索各个关键分子及不同分型的胃癌临床病理学特征及预后;2、探索IFN-γ通过JAKs-STATs通路调控胃癌细胞PD-L1及MICA表达的机制;3、体外研究MICA/NKG2D和PD-1/PD-L1共同调节胃癌细胞免疫逃逸的机制;4、研究肿瘤微环境中MICA与PD-L1状态对胃癌接受细胞因子诱导的杀伤细胞疗效影响。研究方法:第一部分:纳入胃癌接受D2根治术后且接受系统术后辅助治疗的患者,采用特异性抗体(SP142、SP16),免疫组化检测肿瘤微环境中PD-L1和CD8+T细胞浸润程度,同时对相关指标建立相应的评分体系,最终将胃癌分为四种不同免疫亚型,同时检测肿瘤细胞MICA的表达,分析各个关键分子及不同免疫分型的临床病理特征及预后。第二部分:IFN-γ干预胃癌细胞株,Western blot及RT-q PCR检测IFN-γ干预前后PD-L1和MICA的表达变化情况,同时检测下游JAKs/STATs通路关键分子的磷酸化及总蛋白变化情况;进一步选用特异性蛋白抑制剂、CRISPR-Cas9基因敲除的技术来验证IFN-γ调控PD-L1和MICA表达的下游分子信号机制;第三部分:采用转染过表达载体、CRISPR/Cas9敲除基因等技术,构建不同表型状态(PD-L1、MICA)的胃癌细胞株,体外扩增特异性的CD8+T细胞以及非特异杀伤细胞NKT细胞,采用LDH法、抗体封闭实验等,探索MICA/NKG2D和PD-1/PD-L1如何共同调节特异性杀伤细胞以及非特异性杀伤细胞的杀伤效应。第四部分:回顾性分析我院2009-2011年胃癌患根治术后患者,同时接受了术后标准的辅助化疗和至少2个周期CIK辅助治疗方案。根据第一部分建立的针对MICA及PD-L1的染色评分体系进行检测。分析肿瘤微环境PD-L1及MICA状态对CIK治疗疗效潜在影响。结果:第一部分:在186个样本中,60.3%(112/186)的患者PD-L1阳性表达(TC=1/2/3或者IC=1/2/3)。PD-L1的表达强度与CD8+T细胞浸润数量之间存在显著相关性(P=0.000)。根据免疫相关的分类,I型(CD8+T+/PD-L1+)、II型(CD8+T-/PD-L1-)、III型(CD8+T-/PD-L1+)、IV型(CD8+T+/PD-L1-)分别占60.3%,11.8%,0%,和27.9%。II型患者DFS、OS显著劣于I型和IV型患者;I型和IV型患者之间的DFS、OS无显著统计学差异(I型和II型,P=0.015,P=0.003;IV型和II型,P=0.017,P=0.005;I型和IV型,P=0.806,P=0.808;)。另外,MICA低表达116例,占62.4%;高表达70例,占37.6%。MICA蛋白表达状态与肿瘤分期存在明显相关,p=0.002。MICA表达与PD-L1显著负相关,p=0.027;同时,MICA表达与CD8+T细胞浸润及免疫分型均存在交界性相关(p=0.081,p=0.061)。第二部分:IFN-γ干预胃癌细胞0、4、12、24h后,PD-L1蛋白表达与m RNA表达量上调,MICA蛋白表达及m RNA表达量出现下调,存在时间-效应关系。Western blot分见p JAK1、p JAK2以及p STAT1活化最明显,且其表达与MICA及PD-L1同步;应用特异性的JAK1,JAK2抑制剂或者CRISPR/Cas9敲除STAT1基因,均可抑制IFN-γ诱导PD-L1上调表达以及MICA下调表达这一分子现象。第三部分:LDH法检测结果显示:CD8+T细胞杀伤对MICAko/PD-L1oe-BGC-823细胞杀伤率低于PD-L1ko-BGC-823以及PD-L1oe-BGC-823(p<0.05,p<0.001),对MICAoe/PD-L1ko-BGC-823的杀伤效率显著高于MICAoe-BGC-823以及MICAko-BGC-823(p<0.01,p<0.001)。而NKT细胞对PD-L1ko-BGC-823、PD-L1oe-BGC-823以及MICAko/PD-L1oe-BGC-823杀伤率无显著差异;对MICAoe/PD-L1ko-BGC-823以及MICAoe-BGC-823的杀伤效率无统计学差异(p>0.05),但均显著高于MICAko-BGC-823(p<0.001,p<0.001)。NKG2D单抗封闭CD8+T细胞后,可见到CD8+T细胞对PD-L1oe-BGC-823的杀伤率显著下调(p<0.01),而NKG2D+PD-1单抗联合封闭CD8+T细胞后,对比PD-1单抗单独封闭发现,两抗体同时封闭对PD-L1oe-BGC-823的杀伤率明显下降(p<0.001)。第四部分:95例胃癌术后接受辅助化疗联合CIK患者中,MICA低表达57例(60%),高表达38例(40%)。PD-L1阴性41例(43.2%),阳性54例(56.8%)。MICA高表达的患者,DFS和OS明显优于MICA低表达的患者,分别为46.0月vs.41.0月(p=0.027)、48.0月vs.42.0月(p=0.031),而PD-L1状态与DFS及OS无明显相关。多因素COX回归模型显示,肿瘤分期及MICA蛋白表达状态是胃癌术后接受CIK治疗DFS及OS的独立预测因素。结论:1、在胃癌组织中,CD8+T细胞浸润程度是胃癌的独立预后因素。PD-L1表达与CD8+T细胞浸润程度显著相关。我们的研究中,III型胃癌缺失,II型预后明显差于I型和IV型。MICA表达与PD-L1存在显著的负相关。2、IFN-γ可以显著诱导胃癌细胞PD-L1上调表达,同时出现MICA诱导性下调,这两个分子事件均依赖于JAK1/2-STAT1的磷酸化。3、MICA/NKG2D以及PD-1/PD-L1共同调控了CD8+T细胞对胃癌细胞的杀瘤效应,MICA的下调可能是PD-1单抗在PD-L1阳性胃癌的一个原发耐药机制。4、胃癌术后接受化疗联合CIK治疗的患者,肿瘤组织MICA蛋白高表达是接受CIK治疗的疗效较好的预测因素,而PD-L1的状态对患者的生存无显著影响。