研究背景:针对急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）分化障碍的特征,全反式维甲酸（All-trans retinoic acid,ATRA）被用于诱导分化治疗急性早幼粒细胞白血病（Acute promyelocytic leukemia,APL）获得巨大成功。但是至今为止,肿瘤分化治疗仍存在局限性,包括临床可用药物少和临床适用范围窄等。因此,寻找肿瘤细胞分化调控的新分子靶点与信号通路,并基于该靶点和信号通路研究分化治疗的新方法和新手段,是现阶段分化治疗药物研究的热点和难点问题。我们前期研究发现细胞周期依赖性激酶2（Cyclin dependent kinase 2,CDK2）在急性髓性白血病细胞被诱导分化过程中发生明显下降,且泛素蛋白酶体抑制剂MG132可以逆转CDK2的下降过程。虽然CDK2蛋白的功能研究一直集中在细胞周期调控方面,但是多项研究结果提示CDK2可能不是细胞生长所必须的分子,并且越来越多的研究表明CDK2表达或活性下降对于细胞自我更新和分化具有重要意义。以上提示我们,CDK2蛋白可能可以作为一个分化抑制因子被泛素蛋白酶体所降解,进而参与调控AML细胞分化进程。因此,我们希望研究CDK2蛋白在AML细胞分化中的蛋白下降模式及其分子调控机制,并且探索CDK2蛋白是否在急性髓性白血病细胞分化中扮演分化抑制因子的角色,对于寻找新的肿瘤分化治疗策略具有积极意义。研究目的:本研究的目的是系统探讨CDK2的泛素化降解在急性髓性白血病细胞分化中的作用及其分子机制。具体分为三章:1)明确急性髓性白血病细胞分化过程中CDK2发生泛素化降解,并深入探讨CDK2泛素化降解的分子机制。2)采用基因调控和小分子抑制剂考察CDK2在急性髓性白血病细胞分化过程中所扮演的角色,以期发现CDK2的新生物学功能。3)采用表达谱分析法寻找CDK2泛素化降解调控急性髓性白血病细胞分化的下游网络及其关键因子,并通过质谱检测CDK2的相互作用蛋白进而寻找CDK2参与调控急性髓性白血病细胞分化的直接作用靶点。第一章:急性髓性白血病细胞分化过程中CDK2蛋白的泛素化降解及其分子机制研究方法:采用流式细胞术结合CD11b考察AML细胞株（HL60、U937和NB4）在不同分化诱导剂作用后的分化情况;采用Western blot检测AML细胞株被诱导分化过程中的CDK2蛋白水平变化;采用人淋巴细胞分离液从AML病人骨髓血液样本中分离人原代AML样本（Leu-1、Leu-2和Leu-3）;采用实时荧光定量PCR考察不同分化诱导剂作用AML细胞株后CDK2基因水平变化;采用蛋白酶体抑制剂和自噬溶酶体抑制剂分别与分化诱导剂联合使用确定CDK2蛋白的降解模式;采用免疫沉淀技术考察CDK2蛋白的泛素化修饰水平;采用赖氨酸突变为精氨酸的方式寻找CDK2蛋白的优先泛素化位点;采用酵母双杂交技术寻找CDK2蛋白的特异性泛素化E3酶;采用免疫沉淀技术确证CDK2蛋白和E3酶的相互结合;采用shRNA干扰技术沉默E3酶,检测CDK2蛋白的降解半衰期。研究结果:1)急性髓性白血病细胞分化过程中CDK2发生泛素化降解:①CDK2在急性髓性白血病分化过程中蛋白水平发生特异性下降:四种分化诱导剂（ATRA、TPA、DMSO和Dasa）在诱导AML细胞株发生分化时,CDK2蛋白发生显著下降;ATRA诱导原代AML样本发生分化时,CDK2蛋白发生明显下降;ATRA在诱导骨肉瘤细胞株U20S细胞发生分化时,CDK2蛋白水平保持相对稳定。②CDK2在急性髓性白血病细胞分化过程中的下降与基因水平调控无关:实时荧光定量PCR结果显示,四种分化诱导剂对AML细胞株的CDK2 mRNA水平没有显著影响;③CDK2在急性髓性白血病细胞分化过程中的下降依赖于泛素蛋白酶体通路降解:AML细胞株在ATRA作用后所发生的CDK2蛋白下降可以被蛋白酶体抑制剂MG132所逆转,但不能被自噬抑制剂3-MA和CQ所逆转;TPA作用AML细胞株所引起的CDK2的下降同样可以被MG132抑制。2)急性髓性白血病细胞分化过程中CDK2泛素化降解的的分子机制:①CDK2可发生多聚泛素化修饰:在COS7细胞中共表达CDK2-HA和His-Ub,免疫沉淀结果显示CDK2可以发生多聚泛素化修饰,且MG132可以进一步累积这种修饰;当Ub的48位赖氨酸被突变为精氨酸后,CDK2的多聚泛素化修饰受到明显抑制;②CDK2泛素化降解的优先泛素化修饰位点是129位和142位赖氨酸:当CDK2的129位和142位赖氨酸突变为精氨酸后,蛋白合成抑制剂CHX介导的CDK2蛋白水平下调被部分逆转,而当两者同时突变时则可以完全抑制CDK2蛋白下降;在9个潜在泛素化位点被全突变的基础上,只有129位或142位重新突变为赖氨酸后,CDK2重新发生泛素化降解;③介导CDK2泛素化修饰的泛素E3连接酶是KLHL6蛋白:酵母双杂交技术联合E3s库发现共有10个潜在的泛素化E3酶和CDK2结合,其中KLHL6可以明显促进CDK2泛素化修饰水平;过表达KLHL6可以加快CDK2蛋白的降解速度,而沉默KLHL6则可以减慢CHX引起的CDK2蛋白水平下降速度。第二章:CDK2的泛素化降解对急性髓性白血病细胞分化的作用研究研究方法:采用shRNA干扰联合慢病毒感染沉默AML细胞株中的CDK2蛋白;采用细胞计数和台盼蓝拒染法考察CDK2沉默后对AML细胞的增殖和存活的影响;采用细胞表面抗原CD11b表达水平、对NBT的还原能力和细胞核形态变化检测CDK2沉默后对AML细胞分化的作用;采用同义突变进行CDK2蛋白在shRNA基础上重新过表达;采用CDK2小分子抑制剂抑制CDK2的激酶活性,并考察其对AML细胞的诱导分化作用;采用PI单染结合流式细胞术考察CDK2抑制剂对AML细胞的死亡诱导情况;采用裸小鼠腋下接种AML细胞,并瘤内注射shCDK2慢病毒,通过检测肿瘤体积和瘤内细胞的CD11b表达水平检测CDK2对AML肿瘤生长影响;采用NOD-SCID小鼠尾静脉注射shCDK2慢病毒感染的AML细胞,流式检测hCD45/mCD45水平或者血涂片染色考察NOD-SCID AML小鼠的外周血液中的AML细胞的浸润情况,并定期检测CDK2对AML小鼠的生存时间的影响。研究结果:1)CDK2蛋白水平下降对急性髓性白血病细胞分化的作用研究:①沉默CDK2对急性髓性白血病细胞增殖的影响:采用shRNA联合慢病毒感染沉默AML细胞株中的CDK2蛋白,shCDK2#2效果最好,shCDK2#3次之,shCDK2#1相对较弱;三个shCDK2均可以明显抑制AML细胞的增殖,且shCDK2#2效果最强,shCDK2#3次之,shCDK2#1相对较弱;②沉默CDK2对急性髓性白血病细胞分化的影响:三个shCDK2均可以明显上调CD11b的表达（从对照组的5.39 ± 1.59%分别上升到 33.7 ± 0.18%、55.0 士 6.09%和 40.7 ± 2.54%）;三个 shCDK2 均可以增强细胞NBT还原能力;shCDK2组的AML细胞核多呈现半月形,同时核质比明显减少;shCDK1和shCDK2均可以明显抑制AML细胞的增殖,但只有shCDK2可以明显促进AML细胞分化;③沉默CDK2对急性髓性白血病病人临床样本的诱导分化作用:shCDK2#2感染的原代样本的CD11b表达水平明显上调,细胞核形态发生明显变化以及细胞分化相关转录因子STAT1、PU.1和CEBPP均发生明显上调。2)CDK2的激酶活性抑制对急性髓性白血病细胞分化的影响:①CDK2显性失活突变体D145N参与调控AML细胞分化进程:细胞分化表面标志物CD11b和瑞氏吉姆萨染色结果均显示,在shCDK2#2促进AML细胞株发生分化的基础上,重新过表达HA-CDK2（CM14）可以抑制这一效应,而HA-D145N（CM14）则没有类似的逆转shCDK2介导的分化效果;②CDK2小分子抑制剂诱导AML细胞发生分化:三个CDK2抑制剂（SU9516、CVT313和Nu6102）在不会导致AML细胞株发生明显的死亡的基础上,可以促使AML细胞的CD11b表达升高,NBT还原能力显著增强。3)抑制CDK2诱导急性髓性白血病细胞分化的体内抗肿瘤活性研究:①CDK2下降通过诱导AML细胞分化抑制裸鼠腋下移植瘤生长:Scramble组的瘤体积不断增长,而shCDK2组肿瘤增长明显受到抑制（在实验结束时,对照组瘤体积为 2539 ± 386 mm3,shCDK2 组为 969± 188 mm3）;shCDK2 组的瘤内细胞CDK2水平相较于Scramble组发生明显下降;与Scramble组相比,shCDK2组的CD11b表达水平显著增加;②CDK2下降通过诱导AML细胞分化延长NOD-SCID白血病小鼠生存时间:Scramble组的小鼠血液中hCD45+mCD45-的比例随着时间的延长明显增加（在第32天、第38天和第40天分别为2.04 ± 0.92%、6.91 ± 3.47%和 24.85 ± 8.03%）,而 shCDK2 组血液中的 hCD45+mCD45-的比例一直保持在较低状态（在第32天、第38天和第40天分别为1.08 ± 0.53%、1.71 ±1.33%和1.34 ±1.16%）;血涂片结果同样显示Scramble组的小鼠血液中存在较高比例的人源性HL60细胞,而shCDK2组则检测不到;Scramble组的5只小鼠分别在第41、43、43、44和44天死亡,而相对应的shCDK2组的小鼠没有发生明显的死亡情况。第三章:CDK2的泛素化降解调控急性髓性白血病细胞分化的分子机制探索研究方法:采用实时荧光定量PCR技术考察CDK2沉默后分化相关因子的mRNA水平;采用基因芯片考察抑制CDK2诱导分化过程中AML细胞的基因表达情况;采用Cluster程序对差异性基因进行分层聚类分析;采用shRNA联合慢病毒感染技术沉默AML细胞中MAFB的表达;采用冰冻切片联合免疫荧光技术考察裸鼠腋下肿瘤中MAFB和CDK2的蛋白水平;采用Western blot技术检测CDK2沉默诱导AML细胞分化过程中PML/RARα的降解情况;采用RARE荧光素酶报告基因系统检测shCDK2对RARα转录活性的影响;采用免疫沉淀富集CDK2蛋白并联合LC/MS/MS技术寻找与CDK2相互作用的蛋白;采用DCFDA探针检测shCDK2诱导AML细胞分化过程中细胞内H₂O₂的水平变化;采用免疫沉淀技术确证CDK2蛋白与过氧化物酶家族PRDXs蛋白的结合情况;采用Western blot技术检测下调CDK2介导的AML细胞分化过程中PRDXs的蛋白水平;采用大肠杆菌原核系统体外纯化CDK2和PRDX2重组蛋白;采用经典的TRX/TRXR/NADPH偶联PRDX酶活体系检测体外PRDX的过氧化物酶活性;采用shRNA技术联合慢病毒感染沉默AML细胞中的PRDX2水平,并结合CD11b表达、NBT还原能力和核形态检测AML细胞的分化水平。研究结果:1)CDK2泛素化降解调控分化的下游网络及其关键因子寻找:①沉默CDK2诱导急性髓性白血病细胞分化过程的基因表达谱分析:采用人基因表达谱芯片AffymetrixU133 Plus2.0分析发现,在第2天和第5天中分别有35（其中18个上调,17个下调）和499（其中473个上调,26个下调）个基因呈现出显著性变化,而其中有16个基因在两个时间点的三个shCDK2组中都发生明显上调;②MAFB在CDK2调控急性髓性白血病细胞分化过程中的关键作用:在这16个基因中,MAFB的上调倍数最为明显（在三组shCDK2中分别上调151、64和252倍）;在CDK2沉默的AML细胞株中,MAFB的蛋白表达发生上调;在腋下瘤组织中,shCDK2组的MAFB的蛋白表达也呈现上调趋势;shMAFB#1和shMAFB#2均可以明显的抑制第2天和第5天时shCDK2介导的CD11b上调和NBT还原能力的增加。2)CDK2调控急性髓性白血病细胞分化的直接作用靶点及分子机制寻找:①CDK2下降诱导分化过程中对PML/RARα及RARα的影响:shCDK2不能降解PML/RARα,且对RARα蛋白水平没有影响;RARE荧光素酶报告基因系统结果表明,shCDK2不能促进RARα转录活性的增加;②H₂O₂在CDK2抑制诱导AML细胞分化过程中发挥重要作用:相较于Scramble组,shCDK2#2组的AML细胞呈现明显的H₂02累积现象;H₂02清除剂NAC可以明显的抑制shCDK2介导的CD11b表达水平的上调和NBT还原能力的增加;③CDK2通过直接作用PRDX2调控急性髓性白血病细胞分化过程:LC/MS/MS检测结果显示,共有68个蛋白被富集到CDK2蛋白上,其中包括了两个PRDXs家族成员（PRDX1和PRDX2）;在AML细胞株中PRDX1和PRDX2均表达,但是只有PRDX2和CDK2相互作用;shCDK2不影响AML细胞中PRDX2的蛋白表达水平;体外酶活实验结果显示,CDK2可以显著促进PRDX2对NADPH的消耗能力;shPRDX2可以介导AML细胞的CD11b表达水平发生上调、NBT还原能力显著增加,以及核形态呈现半月形或马蹄形等粒性成熟特征。研究结论:本研究发现在急性髓性白血病细胞被诱导分化过程中CDK2蛋白发生了KLHL6介导的特异性泛素蛋白酶体降解;而进一步研究则显示基因沉默或采用小分子化合物抑制CDK2均可以诱导急性髓性白血病细胞退出分化阻滞,进而抑制肿瘤体积的增长,延长AML白血病小鼠的生存时间;基因表达谱分析和质谱检测结果揭示CDK2可能是通过靶向PRDX2促进其过氧化物酶的活性,进而导致细胞内H₂02的下降,抑制下游分化通路的转录激活,最终发挥其分化阻滞的作用。本研究不仅发现了 CDK2在AML细胞分化过程中的新生物学功能,而且提示CDK2可能可以作为急性髓性白血病分化治疗的潜在新靶点。