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背景卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)是脑卒中后最常见的神经精神障碍性疾病,影响患者日常生活能力的恢复及神经功能缺损,致残率及致死率也逐渐升高。机体受到外界应激从而激活下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamo-pituitary-adrenal,HPA)轴,下丘脑室旁核处促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)短时间内以正反馈的方式使促肾上腺皮质激素释放激素受体1(corticotropin-releasinghormonereceptor 1,CRHR1)表达上调,CRHR1通过与刺激性G蛋白的α亚基(Gs-α)偶联来传递信号,导致腺苷酸环化酶的刺激,产生第二信使环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphat,cAMP)。cAMP的积累反过来刺激蛋白激酶A(cyclic-AMP dependent protein kinase A,PKA)的激活,使cAMP反应元件结合(cAMP response element binding protein,CREB)蛋白磷酸化,使位于细胞核CRH启动子上的cAMP反应元件(CRE)磷酸化,诱导pCREB-BDNF-TrkB通路影响认知功能的改变。目的本研究拟探讨慢性应激对脑卒中大鼠行为学水平和CRHR1、pCREB、BNDF、TrkB表达的影响,探讨CRHR1在卒中后受到慢性应激的过程中的作用机制。方法1.制备PSD模型大鼠:选取180-200g的雄性SPF级SD大鼠,随机分为假手术组、卒中组、抑郁组和PSD组;其中卒中组和PSD组采用左侧大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion model,MCAO)法制备大脑中动脉缺血再灌注模型,选取Longa评分评估神经功能损伤≥1分且<4分的大鼠入组;假手术组在仅分离出左侧颈总动脉及颈内动脉,不进行线栓法;抑郁组采用单纯慢性不可预知性温和刺激造模,PSD组在MCAO术后1周给予慢性不可预知性温和性刺激(chronicunpredictable mild stress,CUMS)。采用体重变化情况、蔗糖水偏好指数(sucrose preference test),高架十字迷宫,旷场实验(open-field test,OFT),Y迷宫评估大鼠快感缺失,抑郁、焦虑样行为、运动探索能力和学习记忆能力等认知行为。通过与抑郁组模型大鼠进行比较行为学,筛选出慢性应激对脑卒中后刺激成功制备的PSD组模型大鼠,进行基因、蛋白和形态学的实验。2.实时荧光定量PCR(q-PCR)方法检测各组模型大鼠海马CRHR1、CREB、BDNF、TrkB mRNA的表达水平。3.蛋白免疫印迹法(Western Blot)法检测各组模型大鼠海马CRHR1、pCREB和CREB、BDNF、TrkB的蛋白表达水平。4.采用尼氏染色法观察模型大鼠海马CA1区神经元的形态结构和损伤情况。结果1.行为学结果:第7天(基线)各组模型大鼠之间各项行为学测验比较无统计学差异(P>0.05)。卒中组和PSD组在行MCAO手术后1周出现相应的认知功能障碍,后期逐渐恢复。第42天(MCAO术后1周+CUMS刺激4周),PSD组的体重变化显著低于假手术组和卒中组(P<0.01),与抑郁组比较有差异(P<0.05);抑郁组的蔗糖水偏好指数低于假手术组(P<0.05),PSD组的蔗糖水偏好指数显著低于假手术组、卒中组和抑郁组(P<0.05)。PSD组的各项行为学评估分数显著低于假手术组、卒中组(P<0.05)。PSD组的高架十字迷宫进入开放臂的时间比显著低于假手术组、卒中组和抑郁(P<0.05)。PSD组的旷场试验中的水平运动距离显著低于假手术组、卒中组(P<0.05)。PSD组Y迷宫新异臂正确交替次数百分比假手术组、卒中组和抑郁组明显下降,抑郁组的Y迷宫新异臂正确交替次数百分比假手术组下降(P<0.05)。2.q-PCR检测结果显示:PSD组海马区CRHR1 mRNA表达水平较假手术组和卒中组显著增高(P<0.01)。PSD组CREB基因表达水平与假手术组显著降低(P<0.01);与假手术组比,卒中组CREB基因表达平降低(P<0.05);PSD组CREB基因表达水平低于卒中组,但无统计学意义(P<0.05)。PSD组BDNF mRNA相对表达水平较假手术组和卒中组明显降低(P<0.01),卒中组BDNF mRNA表达水平较假手术组比较显著降低(P<0.05)。PSD组TrkB mRNA表达水平较假手术组显著降低(P<0.01),卒中组TrkB mRNA表达水平较假手术组降低(P<0.05)。3.Western Blot检测结果显示:PSD组的CRHR1表达水平比假手术组和卒中组显著增高;PSD组pCREB蛋白表达水平较假手术组和卒中组明显降低(P<0.05)。PSD组海马区的CREB蛋白表达水平较假手术组降低(P<0.05)。PSD组BDNF蛋白表达水平显著低于假手术组和卒中组(P<0.01)。与假手术组相比,卒中组和PSD组TrkB蛋白表达水平降低(P<0.05),PSD组TrkB蛋白表达水平较卒中组减低,但无统计学意义(P>0.05)。4.尼氏染色结果显示:卒中组和PSD组的椎体细胞层有不同程度的疏松,神经元的形态结构与假手术组比较有明显的异常,其中卒中组细胞的个数减少程度轻,细胞间隙稍增大;PSD组胞核明显缩小,细胞质萎缩、出现空洞,轴突树突结构不完整,甚至出现细胞结构消失,尼氏小体排列散漫、数量上严重减少,神经元损伤严重。结论脑卒中后大鼠受到慢性应激刺激后可能激活了脑卒中大鼠海马区CRHR1的表达,并激活其下游通路pCREB-BDNF-TrkB,导致卒中后抑郁大鼠海马神经元损伤,认知功能下降。