碳纳米管（Carbon Nanotubes，CNTs）是由卷曲的石墨片层形成的一种一维圆柱形微粒，总体上可分为单壁碳纳米管（single-walled carbon nanotubes，SWNTs）、多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotubes，MWNTs）两种。SWNTs直径在0．4～2纳米，MWNT直径在2～100纳米，它们的长度可达微米级。 碳纳米管能与细胞结合并能穿透细胞膜，正是基于这些独特性质人们致力于碳纳米管在生物和医药领域的开发和应用。通过引入功能化基团，功能化碳纳米管（functionalized CNTs，f-CNTs）的水溶性和生物相容性得到改善，从而为其在生物医学领域的应用奠定了基础。巨噬细胞是免疫系统中的重要细胞，在免疫反应的多个阶段发挥作用，其主要功能是清除异物、调节免疫反应和炎症反应。功能化多壁碳纳米管（f-MWNTs）进入机体后，是否会对巨噬细胞产生毒性并影响其生物学功能目前尚不清楚。我们率先开展该领域的研究，并取得了一些初步的成果。 目的： 1、探讨商品化多壁碳纳米管（p-MWNT）经过不同修饰后得到的83种功能化碳纳米管，引发PMA诱导的THP-1单核巨噬细胞毒性、细胞功能影响与其功能化修饰之间的关系。在此基础上，以毒性差异较为显著的4种功能化碳纳米管作为研究对象，初步探讨其对原代巨噬细胞--小鼠腹腔巨噬细胞的毒性影响。 2、初步建立人原代单核细胞诱导巨噬细胞的方法，并观察单核细胞在功能化多壁碳纳米管（f-MWNTs）的微环境中分化成巨噬细胞时，其表型与功能的变化。 方法： 1．功能化多壁碳纳米管对原代小鼠腹腔巨噬细胞的毒性影响。 1．1 基于组合化学方法液相合成含有83种f-MWNTs的多壁碳纳米管库，产物用傅立叶红外，元素分析及高效液相色谱表征其功能化基团。 1．2 f-MWNTs以不同浓度作用于PMA诱导的THP-1细胞，通过检测细胞增殖及NO生成情况，初步筛选了p-MWNT和83种f-MWNTs对PMA诱导的THP-1单核巨噬细胞的毒性。 1．3 由小鼠腹腔获得原代巨噬细胞。 1．4 根据1．2的初步筛选结果，挑选出四种不同毒性的f-MWNTs，进一步研究其对小鼠腹腔巨噬细胞的影响。将选出的四种f-MWNTs以不同浓度梯度与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育，检测细胞增殖和细胞内活性氧的产生情况。 2．人原代单核细胞诱导巨噬细胞方法的建立及功能化多壁碳纳米管对其影响。 2．1 取正常人外周血，密度梯度离心法分离单个核细胞（PBMCs），用2h贴壁法获得单核细胞（monocytes）。 2．2 粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导单核细胞，6～7天获得成熟的巨噬细胞。 2．3 在2．2所述刺激过程，同时加入功能化多壁碳纳米管共孵育，观察所得巨噬细胞与正常诱导巨噬细胞不同。 结果： 1．功能化多壁碳纳米管对小鼠腹腔巨噬细胞的毒性影响。 1．1 成功获得了含有83种不同基团修饰的多壁碳纳米管库。 1．2 83种f-MWNTs作用于PMA诱导的THP-1单核巨噬细胞，当作用剂量由50μg/mL增加到200μg/mL时，细胞存活率由60％左右降至30％左右；其诱导NO的生成不仅具有剂量依赖性，也与其功能化基团有关。 1．3 显微镜下观察由小鼠腹腔获得的原代巨噬细胞具有典型巨噬细胞形态。 1．4 f-MWNTs 2＃、43＃、49＃和67＃与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育3～24小时：1）24小时后即可在显微镜下观察到f-MWNTs被巨噬细胞摄入至细胞质的现象。2）2小时后即可检测到细胞内ROS升高四种碳纳米管在较高作用剂量，大于400μg/mL时明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞的存活率：其中67＃所引起的细胞毒性最小。 2．人外周血单核细胞诱导巨噬细胞方法的建立及功能化多壁碳纳米管对其影响。 2．1 显微镜下观察由人外周血单核细胞诱导的巨噬细胞具有典型巨噬细胞形态。 2．2 显微镜下观察与f-MWNTs共孵育获得的由人外周血单核细胞诱导的巨噬细胞：1）可在显微镜下观察到f-MWNTs被巨噬细胞摄入至细胞质的现象。2）细胞形态明显变大，胞质中有吞噬小泡产生。 结论： 1．由组合化学方法得到的功能化多壁碳纳米管，其表面修饰基团具有高度多样性。 2．f-MWNTs作用于PMA诱导的THP-1单核巨噬细胞，引起免疫反应的差别主要由功能化修饰基团的不同造成。经过分析，以AC005为修饰基团的一组f-MWNTs所引起的免疫反应普遍较小；而其他修饰基团仅有个别材料表现出较好的生物相容性。 3．对于原代巨噬细胞来说，f-MWNTs引发的免疫反应与修饰基团有关，其影响有弱到强依次为2＃、43＃、49＃、67＃。p-MWNTs仅经过简单羧基化修饰后，增加了材料的水溶性的同时也加剧了其引起的免疫应激。经过进一步的氨基酸和酰胺基团修饰后，其生物相容性大大改善。 4．f-MWNTs作为外源异物作用于巨噬细胞，在较短时间内引发巨噬细胞呼吸爆发，表现为细胞内活性氧水平明显升高。 意义： 本研究首次探讨了基于组合化学方法合成的功能化多壁碳纳米管对巨噬细胞的毒性及其细胞功能的影响，分析其中的构效关系，并初步探讨了功能化多壁碳纳米管引起巨噬细胞免疫毒性的机制。