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第一部分缺氧预适应保护心肌细胞拮抗H2O2诱导的氧化应激损伤目的:培养原代心肌细胞(primary cardiomyocyte,CM)及H9c2细胞系,构建H2O2诱导的心肌细胞氧化应激损伤模型,检测缺氧预适应(hypoxic preconditioning,HPC)的保护效应。方法:无菌环境下切取1~3天新生Sprague Dawley(SD)大鼠的心脏,结合酶消化法、差速贴壁法体外分离培养CM细胞,倒置相差显微镜下观察心肌细胞生长形态,免疫荧光染色检测α-辅肌动蛋白(α-actinin)和波形蛋白(vimentin)。H9c2细胞、CM细胞分为常氧组、HPC组,HPC组细胞在1%O2+5%CO2低氧环境中培养30min,然后在21%O2+5%CO2常氧环境中恢复30min,随后添加不同浓度的H2O2(0μM、50μM、100μM、200μM、400μM)诱导氧化应激损伤,CCK-8法检测细胞活力。Western blot(WB)检测cleaved caspase-3蛋白表达水平,流式细胞术及TUNEL染色观察心肌细胞凋亡情况。结果:倒置相差显微镜下,新鲜提取的CM呈圆形,自由悬浮于培养液中;12小时后基本贴壁,呈梭形、杆状或多边形,细胞核大且折光性强;细胞贴壁生长3天后,逐渐生出伪足,部分交联,可见自发性搏动,比例超过90%。免疫荧光检测显示α-actinin呈阳性,vimentin呈阴性。CCK-8结果表明,HPC可提高心肌细胞活力;随着H2O2浓度的增加,细胞活力逐渐降低,当H2O2浓度为200μM时,常氧组和HPC组H9c2、CM细胞的活力较各自基线水平均显著降低(P<0.001)。当暴露于200μM H2O2时,与常氧组相比,HPC组cleaved caspase-3蛋白水平明显降低;流式细胞术及TUNEL染色亦显示HPC可显著减少H2O2诱导的心肌细胞凋亡。结论:酶消化法结合差速贴壁法可成功分离培养CM;H2O2浓度为200μM时,常氧组和HPC组心肌细胞活力受到明显抑制,可用于构建心肌细胞氧化应激损伤模型;HPC可提高心肌细胞活力,减少凋亡,保护心肌细胞拮抗H2O2诱导的氧化应激损伤。第二部分m6A甲基转移酶在HPC心肌保护效应中的作用目的:探索HPC对心肌细胞总RNA中m6A整体水平的影响,研究m6A甲基转移酶在HPC心肌保护效应中的作用。方法:将H9c2、CM细胞分为常氧组、HPC组,H2O2诱导氧化应激损伤,比色法检测心肌细胞总RNA中m6A整体水平,q RT-PCR、WB检测m6A甲基转移酶3(methyltransferase like 3,METTL3)、m6A甲基转移酶14(methyltransferase like 14,METTL14)和Wilms肿瘤1相关蛋白(Wilms tumor 1-associating protein,WTAP)的表达变化。SD大鼠随机分为假手术(sham)组、缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC)组、缺血/再灌注(ischemia/reperfusion injury,I/R)组和IPC+I/R组,HE染色及TUNEL染色检测心肌组织损伤及细胞凋亡,比色法检测心肌组织总RNA中m6A含量,q RTPCR、WB检测心肌组织METTL3、METTL14的表达变化。采用慢病毒敲低METTL3、METTL14,构建HPC-H2O2细胞干预模型,CCK-8、WB及TUNEL染色评估METTL3、METTL14敲低对HPC心肌保护效应的影响。结果:与常氧组相比,HPC组H9c2、CM细胞总RNA中m6A水平显著升高(P<0.001),METTL3、METTL14的表达在m RNA和蛋白水平显著上调(P<0.05),WTAP改变不明显。与I/R组相比,IPC+I/R组细胞凋亡及间质肿胀明显减轻;与细胞实验结果一致,IPC处理后心脏组织中m6A含量增加(P<0.05),METTL3、METTL14的表达明显升高(P<0.05)。METTL3、METTL14基因敲低后,H9c2及CM细胞总RNA中m6A含量明显下降(P<0.001),CCK-8、WB及TUNEL染色结果显示敲低METTL3、METTL14可以逆转HPC诱导的细胞活力增强、cleaved caspase-3蛋白下降及凋亡减少。结论:HPC/IPC可以增加心肌细胞总RNA中m6A含量,提高METTL3、METTL14的表达水平;鉴于METTL3、METTL14基因沉默逆转了HPC诱导的心肌细胞活力增强及凋亡减少,METTL3/14参与了HPC的心肌保护效应。第三部分Lnc RNA H19在METTL3/14调控HPC心肌保护效应中的作用及机制研究目的:研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)H19在HPC心肌保护中的作用及METTL3/14对H19的调控机制。方法:q RT-PCR检测HPC组H9c2细胞、大鼠IPC模型中lnc RNA H19的表达变化。慢病毒转染H9c2细胞构建H19敲低及过表达模型,CCK-8、WB及TUNEL染色评估H19敲低、H19过表达对H9c2细胞活力及凋亡的影响。m6A甲基化RNA免疫沉淀(m6A RNA immunoprecipitation,Me RIP)富集含有m6A甲基化的RNA片段,q RT-PCR定量分析H19中m6A的含量。功能回复实验研究H19过表达对METTL3、METTL14敲低抑制HPC保护效应的影响。利用RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP)技术评估METTL3、METTL14与H19的结合。结果:H2O2及I/R损伤后H19表达显著下降;与常氧组相比,HPC组H9c2细胞中H19表达明显增加(P<0.01);IPC处理后心脏组织中H19含量亦明显升高(P<0.05)。H19敲低组H9c2细胞活力下降明显(P<0.01);HPC+H2O2环境中,H19敲低组cleaved caspase-3蛋白表达增加;TUNEL染色显示,敲低H19增加H2O2诱导的H9c2细胞凋亡。过表达H19可提高H2O2环境中H9c2的细胞活力(P<0.01),显著抑制H2O2诱导的细胞凋亡。Me RIP实验显示,HPC组H19中m6A水平比常氧组明显增加(P<0.05),敲低METTL3、METTL14显著降低H19中m6A水平(P<0.001)。敲低METTL3、METTL14明显下调H19表达水平(P<0.01),H19过表达部分逆转METTL3、METTL14敲低对HPC功能的影响,明显恢复H2O2环境中HPC处理后H9c2细胞活力的增加和凋亡的减少。RIP实验显示,与Ig G组相比,METTL3抗体组、METTL14抗体组结合的H19含量明显升高(P<0.01)。结论:HPC增加了心肌细胞中lnc RNA H19的表达水平;H19在HPC中发挥心肌保护作用;METTL3/14可结合H19,影响其m6A修饰丰度,调控HPC中H19的表达。第四部分METTL3/micro RNA-210在HPC心肌保护效应中的作用及机制研究目的:研究micro RNA-210(mi R-210)在HPC心肌保护效应中的作用及METTL3对mi R-210的调控机制。方法:检索GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中低氧环境下新生大鼠CM的mi RNA表达谱,获得芯片数据集GSE24954并重新分析。q RT-PCR检测常氧组、HPC组CM细胞中mi R-210的表达变化。利用mimics、inhibitors构建了mi R-210过表达及抑制模型。CCK-8、WB及TUNEL染色检测mi R-210过表达对CM细胞活力及凋亡的影响。分析mi R-210及其侧翼序列,q RT-PCR检测METTL3敲低及过表达对mi R-210、原始micro RNA-210(primary mi RNA-210pri-mi R-210)表达的影响。Me RIP实验富集含有m6A甲基化的RNA片段,q RT-PCR定量分析pri-mi R-210中m6A含量。RIP实验分析METTL3过表达对DGCR8蛋白(Di George syndrome critical region gene 8)与pri-mi R-210结合的影响。功能抑制实验检测mi R-210下调对METTL3过表达介导的HPC心肌保护效应的影响。结果:GSE24954芯片结果提示新生大鼠CM细胞中mi R-210对低氧浓度敏感,q RT-PCR结果证实HPC处理后CM细胞中mi R-210表达显著升高。随着H2O2损伤的增加,CM细胞中mi R-210水平逐渐下降;mi R-210 mimics可提高H2O2损伤环境中CM细胞活力,减少cleaved caspase-3蛋白水平及细胞凋亡。抑制METTL3后,mi R-210表达显著降低,而pri-mi R-210表达显著升高;过表达METTL3后,mi R-210表达显著升高,而pri-mi R-210表达显著降低。Me RIP实验显示,过表达METTL3后pri-mi R-210中m6A含量显著增加(P<0.05)。RIP实验表明,过表达METTL3后pri-mi R-210与DGCR8的结合明显增多(P<0.01)。CCK-8、WB及TUNEL染色结果显示,下调mi R-210后HPC中METTL3过表达介导的细胞活力增加及凋亡减少受到显著抑制。结论:HPC显著提高CM细胞中mi R-210的表达水平;mi R-210在HPC中发挥心肌保护作用;METTL3可甲基化修饰pri-mi R-210,提高其m6A水平,在HPC中促进mi R-210的成熟。