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本实验室利用mRNA差异显示技术对灰葡萄孢野生菌株BC4和部分诱变菌株(强除草活性菌株和弱除草活性菌株)进行分析,得到一个694 bp的基因片段,该基因可能调控灰葡萄孢除草活性,本研究利用Genomic Walking技术对该基因片段进行扩增,通过两次5’端Genomic Walking和两次3’端Genomic Walking,将该基因片段694 bp扩增到3961 bp,在NCBI网站进行BLAST比对表明,该基因与富克葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana,灰葡萄孢的有性态)中的calcium/calmodulin dependent proteinkinase(CaMK)同源性98%。根据GenBank报道Botryotinia fuckeliana的完整CDS,从两端设计引物,利用RT-PCR技术克隆了BC4的cDNA全长。Southern杂交结果表明该基因在基因组中以单拷贝形式存在。对CaMK基因进行生物信息学分析,利用DNAMAN软件将CaMK基因cDNA序列与DNA序列进行比对,发现BC4菌株的CaMK基因含有7个外显子和6个内含子。利用DNAStar软件对CaMK蛋白性质进行预测表明,CaMK预测蛋白的分子量为81.8748 kD,共有730个氨基酸,包括95个强碱性氨基酸(K,R),116个强酸性氨基酸(D,E),216个疏水氨基酸(AILFWV),160个极性氨基酸(NCQSTY),等电点(Isoelectrie Point)为6.22。利用ScanPro site软件分析CaMK一级结构中包含的保守结构域结构特征,发现CaMK基因一级结构中包含蛋白激酶ATP结合位点和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点。利用SOPMA软件分析CaMK蛋白的二级结构,用SWISS-MODEL软件构建CaMK蛋白的三维结构模型。用已获得的灰葡萄孢CaMK基因5’端开放阅读框前1330 bp基因组DNA序列在softberry网站中进行启动子可能功能分析。构建了重组CaMK质粒,并成功地在E.coli BL21中得到表达。结果显示重组的CaMK蛋白大量表达在沉淀中,在上清中没有表达。研究的结果为蛋白纯化和蛋白抗体制备以及进一步研究该基因的功能奠定了基础。用CaMK特异性抑制剂KN-62处理灰葡萄孢孢子,结果表明,60μM的KN-62对灰葡萄孢孢子萌发抑制率为50%,80μM的KN-62对孢子萌发抑制率可达98%以上;灰葡萄孢用80μM的KN-62处理后对番茄致病性明显降低,用80μM KN-62处理后所产毒素的除草活性明显下降。表明CaMK基因在灰葡萄孢孢子萌发、致病性以及除草活性物质产生中起重要调控作用。